HepG2細胞胰島素抵抗模型建立影響因素研究

劉迪迪，邱軍強，程翠林，王振宇

（哈爾濱工業大學 化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是Ⅱ型糖尿病的主要致病因素，其特征為機體靶組織對胰島素反應不敏感，外周組織利用葡萄糖水平下降，肝臟細胞不能有效抑制糖異生和糖原分解，即胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出能力下降，造成血糖調節能力紊亂[1-2]。研究表明，機體胰島素抵抗還易引發并促進肥胖癥、高血壓、心血管及動脈粥樣硬化等代謝疾病的發生和發展[3-4]。

從食品或中草藥中篩選有效活性成分來改善胰島素抵抗，治療相關疾病已成為研究的熱點[5-10]。建立穩定可靠的人體外IR細胞模型不僅便于篩選防治IR的有效藥物及活性成分，還可在細胞及分子水平探索IR發病機制[11]。

肝臟是糖代謝最主要器官之一，對維持血糖穩定有重要作用。HepG2細胞來源于肝細胞，是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，保留了肝細胞的許多生物學特性，因此，HepG2細胞是建立體外胰島素抵抗模型的理想之選[12]。

目前相關研究中普遍以高濃度胰島素為模型誘導劑，但文獻報道中，胰島素誘導濃度及作用時間存在一定差異[13-18]，且缺乏更為詳細系統的研究，培養基中是否含血清也很少有明確說明，而諸多因素均會影響到HepG2細胞對葡萄糖的消耗及細胞活性，進而影響胰島素抵抗細胞模型的準確性與穩定性，因此，本試驗展開系統研究，為建立可靠穩定的胰島素抵抗細胞模型提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）；SWCJ-1F單人雙面凈化工作臺（上海藍豹實驗儀器公司）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（上海精密儀器儀表公司）；mindray MR-96A酶標儀（深圳邁瑞）。

1.2 材料與試劑

人肝癌細胞（HepG2，哈爾濱腫瘤醫院）；牛胰島素（INS，源葉生物）；噻唑藍（MTT），RPMI Medium 1640培養基，滅活胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio公司）；葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，上海榮盛）。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養[19]

HepG2細胞復蘇，轉入100 ml細胞培養瓶中，用含10 % FBS的1640培養基，在37 ℃、5 % CO2條件下無菌培養。當細胞貼壁長滿后，棄去培養基，以PBS洗滌細胞，再以0.25 % 胰蛋白酶消化，傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 HepG2細胞培養及分組

將處于對數生長期的細胞消化后，以含10 %FBS的RPMI 1640培養基調整細胞密度為105個/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl繼續培養，每塊板均分為空白組（無細胞）、對照組（無胰島素刺激，正常培養細胞）及模型組。待24 h細胞單層貼壁后，棄去含血清培養基，并以PBS洗滌，更換無血清培養基繼續孵育24 h，棄去培養基，空白組、對照組加無血清培養基，模型組則加入以無血清培養基配制的胰島素培養液，胰島素終濃度分別為5×10-9，5×10-8，5×10-7，5×10-6、5×10-5mol/L，每組10個復孔，每孔100 μl。

2.3 HepG2細胞對葡萄糖的消耗試驗[18,20]

考察不同胰島素濃度及作用時間對細胞消耗葡萄糖的影響：于37 ℃ ，5 % CO2培養箱中孵育72 h，每12 h取培養基上清，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測葡萄糖含量，按下式計算葡萄糖消耗量。

式中：ΔGC為各組細胞的葡萄糖消耗量；GC0為未接種細胞的空白組中葡萄糖含量；GCx為測得各組培養液中葡萄糖含量。

2.4 模型穩定性研究試驗

胰島素作用48 h后，棄去含胰島素的培養基，每孔以PBS洗滌1次，兩塊板分別加入無血清培養基及含10 %血清培養基100 μl，繼續培養，分別于24，48，72 h取上清培養基測定葡萄糖消耗情況，每24 h更換一次培養基。按2.3項公式計算葡萄糖消耗量。

2.5 細胞增殖試驗

葡萄糖消耗試驗結束后，移出培養液，每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，37 ℃培養4 h，棄去培養液，每孔加入 DMSO 150 μl，用酶標儀中速振蕩10 min至紫色結晶完全溶解，再于490 nm波長下檢測各孔吸光度（A），根據A值計算細胞存活率（%）。

2.6 數據統計分析

3 結果與分析

3.1 不同胰島素濃度及作用時間對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

于無血清培養基中加入不同濃度胰島素，分別作用于HepG2細胞12，24，36，48，60，72 h，測定其葡萄糖消耗量，發現添加胰島素的模型組糖代謝出現異常（見圖1）。由圖1可見，葡萄糖消耗量與胰島素濃度呈一定的劑量反應關系，胰島素作用12 h時，隨著胰島素濃度的上升，葡萄糖消耗量也隨之上升，胰島素濃度為5×10-6mol/L時葡萄糖消耗量達到最大，胰島素濃度繼續增大時葡萄糖消耗量降低。由24，36，48 h及60，72 h反應曲線可見，葡萄糖消耗則分別在胰島素濃度為5×10-9，5×10-8或5×10-7mol/L時達到最大，隨胰島素濃度的上升，葡萄糖消耗量下降。可見，隨著誘導時間的延長胰島素濃度升高反而會抑制細胞對葡萄糖的消耗，且作用時間越長發生趨勢改變所需的胰島素濃度越低。說明適當升高誘導濃度可縮短誘導時間，或可通過延長誘導時間來降低誘導濃度。

圖1 不同胰島素濃度及作用時間對HepG2細胞消耗葡萄糖的影響

3.2 胰島素誘導后血清對HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響

HepG2細胞經胰島素作用48 h，棄掉胰島素，加入無血清培養基繼續培養72 h，HepG2 細胞葡萄糖消耗量見圖2。由圖2a可見，隨胰島素濃度的升高，各時段葡萄糖消耗量均隨之增大，胰島素濃度為5×10-6mol/L時，葡萄糖消耗達最大。0～24 h葡萄糖的消耗量遠大于24～48 h及48～72 h，說明隨著時間的延長，細胞消耗葡萄糖的能力逐漸下降，但72 h內趨勢相同。以5×10-5mol/L胰島素濃度作用48 h后，在無血清培養基中培養24 h即可造成葡萄糖消耗量低于對照組。由圖2b可見，胰島素作用濃度為5×10-6mol/L時72 h累計葡萄糖消耗量達到最大值，之后則顯著下降。說明胰島素作用48 h后可誘導HepG2細胞在72 h內保持穩定的模型狀態。

圖2 胰島素誘導后HepG2細胞在無血清培養基中的葡萄糖消耗量

HepG2細胞經胰島素作用48 h，棄掉胰島素，加入含10 %血清培養基繼續培養72 h，HepG2 細胞葡萄糖消耗量見圖3。由圖3a可見，24 h時細胞葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的增大而逐漸增大，胰島素濃度為5×10-6mol/L時，葡萄糖消耗達最大，與無血清培養基中培養時趨勢一致。24～48 h，葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的升高呈先下降后升高趨勢，但各濃度下糖消耗量均低于對照組，且在胰島素濃度為5×10-9，5×10-8，5×10-5mol/L時差異有高度統計學意義（P＜0.01），胰島素濃度為5×10-5mol/L時糖消耗量最低。48～72 h葡萄糖消耗趨勢與24～48 h相似，胰島素濃度為5×10-8mol/L時葡萄糖消耗量最低，其他濃度時差異無統計學意義，可見隨培養時間的延長，不同濃度胰島素對細胞誘導的差異逐漸縮小。由圖3b可見，72 h葡萄糖累計消耗量也隨胰島素濃度的增大呈先降低后升高趨勢，說明細胞對葡萄糖消耗能力受培養時間影響很大，不同時間段可能呈現出不同趨勢，葡萄糖累計消耗情況也會隨之產生變化。與圖2相比可見，培養基中是否含血清對細胞誘導結果會產生不同的影響。以5×10-8mol/L胰島素濃度誘導48 h，在含血清培養基中培養48 h，即可造成HepG2細胞葡萄糖消耗量穩定低于對照組。

3.3 不同濃度胰島素誘導對HepG2細胞增殖的影響

HepG2細胞以不同濃度胰島素誘導后，均對其有促增殖作用，結果見表1。在未添加胰島素的對照組中，24 h時含血清組存活率為不含血清組的1.38倍，48 h，72 h時則分別為1.67倍和2.48倍，說明隨著培養時間的延長含血清培養基中HepG2細胞增殖更迅速。24 h時，胰島素濃度為5×10-9～5×10-6mol/L時，細胞增殖情況差異不大，胰島素濃度為5×10-5mol/L時細胞增殖受到抑制，這與無血清培養基中葡萄糖消耗趨勢相一致。48 h及72 h時，各組細胞存活率均隨胰島素濃度的升高而升高，且變化幅度較24 h時更顯著，即使在高濃度時也未見增殖抑制，說明細胞增殖情況與胰島素濃度呈正相關。含血清培養基中，72 h時各組細胞較48 h時對應各組增殖顯著，說明細胞生長狀況良好。

表1 不同濃度胰島素誘導對HepG2細胞增殖的影響

3.4 不同濃度胰島素誘導對HepG2細胞葡萄糖比消耗率的影響

不同濃度胰島素作用不同時間后，培養基中無論是否添加血清，HepG2細胞葡萄糖比消耗率普遍低于對照組，見圖4、圖5。由圖4、圖5可見，試驗濃度范圍內均可誘導細胞產生胰島素抵抗；24 h時葡萄糖比消耗率相近，可見培養基中是否添加血清對IR形成影響不大。48 h時，無血清培養基和含血清培養基中IR效果先增強后下降。72 h時葡萄糖比消耗率隨著胰島素濃度的升高呈連續下降趨勢，這也與之前得出的隨作用時間延長，發生胰島素抵抗所需胰島素濃度越來越低相吻合。在無血清和含血清培養基中培養24 h，葡萄糖比消耗率相對最低，即細胞普遍呈胰島素抵抗最明顯狀態。

圖4 無血清培養基中葡萄糖比消耗率

圖5 含血清培養基中葡萄糖比消耗率

4 討論與結論

國外從20世紀90年代初即開始這方面的研究，并已成功復制數種胰島素耐受細胞模型[21-22]，這些細胞模型主要有高胰島素誘導培養、高葡萄糖培養、游離脂肪酸（FFA）誘導等模型，其中以高胰島素培養模型最為穩定、可靠，使用也最為廣泛。

胰島素最主要的生物學作用是促進葡萄糖代謝。胰島素抵抗的最主要特征是機體對胰島素促進葡萄糖的攝取發生了抗性。既然低濃度胰島素會促進糖消耗，高濃度胰島素才會產生IR，那么建模所用胰島素濃度的確定對建立模型的可靠性意義重大。

文獻報道，誘導模型所用的胰島素濃度從5.8×10-3mg/ml[17]、30 μg/ml[8]、10 mg/L[18]、10-10mol/L[15]、5×10-7mol/L[14,23]至10-4mol/L[16]不等，誘導時間也從24 h至48 h不等。通過本試驗得出，誘導時間不同，出現胰島素抵抗的濃度也不同，誘導時間越長，所需胰島素濃度越低。HepG2細胞在胰島素中作用48 h后，換不含胰島素培養基繼續培養，在無血清培養基中，低濃度時，葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的升高呈增加趨勢，在5×10-5mol/L時受到抑制。在含血清培養基中，48～72 h培養階段，5×10-8mol/L濃度胰島素誘導的細胞模型葡萄糖消耗量最低。。

不同濃度胰島素在誘導后的72 h內均會促進HepG2細胞增殖，且對葡萄糖消耗產生相應的影響。通過計算比葡萄糖消耗率得出，在此試驗濃度范圍內，葡萄糖比消耗率均低于對照組，即單位細胞葡萄糖消耗能力下降，形成了胰島素抵抗，葡萄糖總消耗量的升高是因為胰島素能促進HepG2細胞體外增殖造成的[24]，而并非單位細胞對葡萄糖消耗能力增強。在無血清培養基中，24 h時5×10-9mol/L誘導的細胞IR最明顯，48 h后則5×10-5mol/L誘導的IR最嚴重。可能是因為在HepG2 細胞表面存在的胰島素受體在不同作用時間下受濃度的影響也不同。在含血清培養基中，誘導后培養24 h時IR較強，其中5×10-9mol/L和5×10-8mol/L時IR最明顯。綜合考慮，選擇5×10-8mol/L胰島素誘導48 h后在含血清培養基中繼續培養24 h，且在5×10-9～5×10-5mol/L 濃度范圍內效果穩定。

因此，誘導HepG2細胞建立胰島素抵抗模型，要根據具體試驗時間，選擇合適的胰島素濃度及培養基，不可一概而論，建議以5×10-8mol/L濃度胰島素誘導48 h，換含血清培養基繼續培養2 h最易形成明顯的胰島素抵抗模型。此HepG2細胞模型在較長的時間內（72 h）均可維持胰島素抵抗特性，可為篩選胰島素增敏劑提供充分的時間。