水質(zhì)安全性評價方法中陽性參照物的篩選及預測無效應濃度值的確定

李啟元， 馬曉妍， 王曉昌， 王永坤

(西安建筑科技大學 環(huán)境與市政工程學院，國家城市非傳統(tǒng)水資源開發(fā)利用國際科技合作基地， 西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室，陜西省污水處理與資源化工程技術研究中心，陜西 西安 710055)

1 研究背景

生態(tài)毒性檢測作為反映水體污染程度和評價水處理技術有效性的重要方法，能夠通過生物指標更直觀、全面地反映水體中的污染物對水生態(tài)環(huán)境中的水生生物的不利影響。生態(tài)毒性檢測主要采用水生生物作為受試體，體現(xiàn)的是綜合的生態(tài)毒性效應。傳統(tǒng)的生態(tài)毒性檢測按照受試生物營養(yǎng)級的不同可分為細菌類(發(fā)光細菌、硝化細菌等)、藻類(普通小球藻、羊角月牙藻、斜生柵藻等)、蚤類(大型蚤、劍水蚤等)、魚類(斑馬魚、青鳉魚等)等毒性檢測[1-2]。

基于生態(tài)毒性試驗的水質(zhì)評價方法有很多，主要包括潛在毒性法、毒性單位分級評價法、潛在生態(tài)毒性效應指數(shù)法和水質(zhì)安全分級法等[3-4]。其中，基于成組生態(tài)毒性檢測的水質(zhì)安全分級方法是Wei 等[5]在2006年建立的更為全面、可靠的評價體系，彌補了其它方法的不足[6]。它是選擇處于不同營養(yǎng)級的3種敏感物種進行毒性測試，提出3種毒性的得分標準，并據(jù)此進行水質(zhì)分級。將水樣的毒性測試結果轉(zhuǎn)化為毒性得分，以3種毒性測試中最差的毒性得分作為水樣的最終得分，以獲得該水樣的水質(zhì)安全等級[7]。該方法中最重要一步是選擇合適的陽性參照物并確定其預測無效應濃度(PNEC)，據(jù)此建立毒性得分標準。

SSD方法可獲得不同物種對某一脅迫因素敏感度，可用于分析化合物引起的生態(tài)風險[8]。最早由 Kooijman (1987)[9]提出，該方法因其簡明、生態(tài)意義明確等優(yōu)點，在國外被廣泛應用。相較而言，國內(nèi)在SSD的研究方面較少。喬敏(2007)等[10]首次使用SSD方法分析多環(huán)芳香烴的生態(tài)風險。因為該方法可將所有的生物都納入考察范圍，在分析化合物對生物的脅迫方面更為全面，近年來亦被廣泛應用于化合物PNEC值的估計[11-12]。

通過查閱文獻、資料及國內(nèi)外標準，發(fā)光細菌毒性檢測的陽性參照物常選擇苯酚和硫酸鋅[13]；微藻生長抑制試驗常選擇重鉻酸鉀[14]和氯化銅[15-16]；水蚤抑制運動試驗常選擇重鉻酸鉀[17]和五氯酚[18]；魚類致死試驗常選擇3,4二氯苯胺和氯化汞[18]。本文利用物種敏感性分布(SSD)方法擬合并計算出這幾種化合物對這4個營養(yǎng)級物種的PNEC值，比較4個物種對其對應兩種陽性參照物的敏感度，選擇出最適合這4個毒性試驗的陽性參照物，為研究者在利用成組生態(tài)毒性檢測的水質(zhì)安全分級評價中毒性得分標準的制定提供依據(jù)。

2 數(shù)據(jù)與方法

2.1 毒性數(shù)據(jù)獲得與篩選

SSD的基本假設即物種敏感性能夠被某分布所描述，而獲得的毒理數(shù)據(jù)來自這個分布，因此可用所查閱到的毒理數(shù)據(jù)估算這個分布的參數(shù)[19]。毒性數(shù)據(jù)主要來自國內(nèi)外發(fā)表的文獻以及USEPA ECOTOX 數(shù)據(jù)庫(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)。根據(jù)該數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)分類確定以下標準：(1) 毒性終點：除藻類選擇半最大效應濃度(EC50)作為毒性終點外，其它物種選擇半數(shù)致死濃度(LC50)作為毒性終點；(2) 暴露介質(zhì)：介質(zhì)選擇淡水；(3) 試驗環(huán)境：選擇實驗室環(huán)境；(4) 暴露時間的選擇：為保證所有參與擬合的數(shù)據(jù)都有較高的一致性，選擇暴露時間為2～4 d。由于苯酚和3，4二氯苯胺關于藻類的毒性數(shù)據(jù)過少，因此將苯酚和3，4二氯苯胺關于藻類毒性數(shù)據(jù)的暴露時間放寬到1～5 d。

2.2 物種分類與數(shù)據(jù)處理

經(jīng)從數(shù)據(jù)庫查詢，篩選并剔除異常值后，苯酚共得543個毒性數(shù)據(jù)，硫酸鋅883個，氯化銅602個，重鉻酸鉀497個，五氯酚657個，3,4二氯苯胺110個，氯化汞481個。對各數(shù)據(jù)進行分組合并，同一物種具有多個數(shù)據(jù)來源的取其算術平均數(shù)[4]。為了分別分析化合物對不同營養(yǎng)級生物的脅迫能力，將全部物種細分為藻類、兩棲類、魚類、甲殼類、昆蟲和蜘蛛類、蠕蟲類、軟體類、其它無脊椎類[20]，并將水蚤從甲殼類中分離出來單獨分析。經(jīng)過物種分組后7種化合物對應各物種的毒性數(shù)據(jù)量如表1所示。

考慮到在樣本估算整體這一過程中太少樣本量帶來的誤差問題， OECD 及澳大利亞水質(zhì)標準推薦的最小數(shù)據(jù)量為5個[21]，還有一些政府指導性文件推薦值為8～10個[22]。本文將著重分析的藻類、魚類、蚤類的擬合數(shù)據(jù)的最小數(shù)量選為5個，其它物種擬合數(shù)據(jù)的最小數(shù)量選為10個，毒性數(shù)據(jù)小于10個的不進行擬合分析。

表1 篩選的7種化合物對應各物種的毒理數(shù)據(jù)個數(shù)

2.3 SSD曲線擬合

應用Burrlioz 2.0軟件，采用澳大利亞及新西蘭的環(huán)境風險評價和環(huán)境質(zhì)量標準中均被推薦的BurrⅢ 模型對SSD曲線進行擬合[21]。BurrⅢ 型函數(shù)如公式(1)所示，其它變形如公式(2)和公式(3)所示。

(1)

式中：x為污染物的質(zhì)量濃度，μg/L；b、c、k分別為函數(shù)的尺度、位置、形狀參數(shù)。

當c趨于無窮大時，BurrIII分布可變化為RePareto分布：

(2)

當k趨于無窮大時，BurrIII 分布可變化為ReWeibull 分布：

(3)

實際應用中，k值>100 時，即可應用ReWeibull分布函數(shù)進行擬合；c值>80 時，采用RePareto 分布進行擬合。

2.4 PNEC值以及PAF的計算

在擬合曲線上對應于5%積累概率的濃度稱為HC5，亦或者稱為95%保護濃度，即當污染物環(huán)境濃度小于該值時，95%的生物都不會受到影響。以HC5值作為化合物的PNEC值[16,23]。可能受物種影響的比例，即PAF值，表示環(huán)境濃度超過生物毒理終點值的物種比例，即給定的污染物濃度在SSD曲線上對應的累積概率，其計算公式等同BurrⅢ型函數(shù)，即公式(4):

(4)

3 結果分析

3.1 SSD曲線擬合結果

根據(jù)物種毒性數(shù)據(jù)參與擬合的最小數(shù)量，將表1中7種化合物所有適合擬合的各物種的毒性數(shù)據(jù)導入軟件進行曲線擬合，并計算出各曲線的參數(shù)。如表2所示。

由表2可知，BurrⅢ 型方程的3種形式在以上物種對7種化合物的SSD曲線均有體現(xiàn)，其中大多數(shù)SSD曲線為BurrⅢ 型或ReWeibull型，RePareto型曲線最少。苯酚的全物種和6個分物種的SSD曲線都適用于ReWeibull型。其它6個化合物的全物種和分物種則主要采用BurrⅢ 型和ReWeibull型兩種擬合模型。只有水蚤對硫酸鋅的SSD曲線和軟體類物種對重鉻酸鉀的SSD曲線采用RePareto模型擬合。

3.2 化合物的PNEC值

7種陽性參照物的PNEC值及其置信區(qū)間如表3所示。由表3可以看出，7種化合物對全部物種的PNEC值大小順序為：苯酚>3,4二氯苯胺>硫酸鋅>五氯酚>重鉻酸鉀>氯化銅>氯化汞。苯酚對全部物種的PNEC值最大，達到5.86×103μg/L，而氯化汞的PNEC值最小，僅有7.30 μg/L。

對苯酚而言，魚類相較之敏感度最高(PNEC值為4.46×103μg/L)，蠕蟲和軟體對苯酚則敏感度較低；對硫酸鋅而言，藻類敏感度最高(PNEC值為27.0 μg/L)，昆蟲/蜘蛛類敏感度最低；氯化銅的PNEC值為11.0 μg/L，這一數(shù)值與吳豐昌等[15]通過毒性百分數(shù)排序法推導出短期質(zhì)量濃度值(9.10 μg/L)以及漁業(yè)標準值(10.0 μg/L)十分接近；各類物種對于氯化汞的PNEC值都很低，全部物種的PNEC值為7.30 μg/L，這一數(shù)值與李會仙等[24]的研究結果相近。對重鉻酸鉀而言，甲殼類靈敏度最高(PNEC值為4.00 μg/L)，魚類敏感度最低，達1.32×104μg/L，兩者相差三個數(shù)量級，即魚類對重鉻酸鉀耐受性很強。對五氯酚而言，全部物種PNEC值為39.0 μg/L，大于雷炳莉等[25]的估算值。魚類的靈敏度最高(PNEC值為29.0 μg/L)，昆蟲類靈敏度最低(PNEC值為490 μg/L)。由于3，4二氯苯胺的毒性數(shù)據(jù)有限，可進行SSD曲線分析的只有藻類和魚類，藻類對3，4二氯苯胺的靈敏度要高于魚類。

3.3 陽性參照物的選擇

生態(tài)毒性檢測中陽性參照物的選擇首先應保證其致毒機理明確；其次是該生物對陽性參照物的響應靈敏，并具有良好的劑量-效應關系；再次是陽性參照物應是較為常見的化合物，以方便研究者使用。為獲得較為靈敏的陽性參照物，本研究選擇通過全物種SSD方法分析各類化合物的物種敏感度，并考慮待測樣品的性質(zhì)進行綜合分析，確定生態(tài)毒性檢測中的陽性參照物。

比較發(fā)光細菌毒性試驗中常采用的陽性參照物苯酚和硫酸鋅，全物種對苯酚和硫酸鋅的敏感度存在明顯差異，見圖1(a)。硫酸鋅對全物種的PNEC值更小，僅為114 μg/L。對于苯酚的SSD擬合曲線，在質(zhì)量濃度小于2.80×103μg/L時，對全物種幾乎沒有影響，隨著質(zhì)量濃度的升高，其PAF才隨著濃度增加而上升。在此后很大一個濃度范圍內(nèi)，兩條曲線坡度相近，說明在此區(qū)間內(nèi)，隨著這兩種化合物濃度的變化可影響的物種數(shù)量相當。在綜合PNEC值及全部物種對苯酚和硫酸鋅的敏感度后，選擇硫酸鋅作為發(fā)光細菌毒性檢測的陽性參照物。

表2 7種化合物對各物種的SSD曲線模型及參數(shù)

表3 7種化合物對各物種的PNEC值及95%置信區(qū)間

對微藻生長抑制試驗中常用的兩種陽性參照物氯化銅和重鉻酸鉀而言，氯化銅的PNEC值(11.0 μg/L)略小于重鉻酸鉀的PNEC值(16.0 μg/L)，濃度很低時全部物種對重鉻酸鉀的敏感度更高，見圖1(b)所示。不過，當質(zhì)量濃度大于9.90 μg/L時，氯化銅的SSD曲線坡度較重鉻酸鉀的更大，即高濃度時，全部物種對氯化汞的敏感度更高。綜合考慮，選擇氯化銅作為微藻生長抑制試驗中的陽性參照物。

水蚤抑制運動試驗的陽性參照物常選取重鉻酸鉀和五氯酚，二者的PNEC值分別為16.0和39.0 μg/L?？傮w來看(圖1(c))，生物對重鉻酸鉀的響應更為靈敏，并且重鉻酸鉀的初始響應質(zhì)量濃度更低。不過重鉻酸鉀的SSD曲線相較于五氯酚的坡度更緩，即在高質(zhì)量濃度時，生物對五氯酚更為敏感。因此，選擇重鉻酸鉀作為水蚤抑制運動試驗的陽性參照物。

魚類致死試驗常采用的兩種陽性參照物為3,4二氯苯胺和氯化汞，其SSD擬合曲線如圖1(d)所示。3,4二氯苯胺和氯化汞的PNEC值分別為361和7.30 μg/L。總體來看，生物對氯化汞的響應更為靈敏。然而，氯化汞的SSD曲線坡度比3,4二氯苯胺的更緩，即在高質(zhì)量濃度段，全部物種對3,4二氯苯胺更敏感。綜合比較后，選擇氯化汞作為魚類的陽性參照物。

3.4 受試物種對陽性參照物的敏感度分析

由于水環(huán)境樣品的毒性試驗多采用水生生物作為受試生物，因此，陽性參照物對該物種的敏感度分析將有利于研究者更深刻理解獲得的毒性數(shù)據(jù)。因此，本文著重討論藻類對氯化銅和重鉻酸鉀的SSD曲線，水蚤對重鉻酸鉀和五氯酚的SSD曲線，以及魚類對3,4二氯苯胺和氯化汞的SSD曲線。由于發(fā)光細菌并不屬于常規(guī)的生物分類方法，并且缺乏化合物對各種發(fā)光細菌的毒性數(shù)據(jù)，尚無法分析發(fā)光細菌對苯酚和硫酸鋅的SSD曲線。

重鉻酸鉀和氯化銅對藻類的PNEC值分別為22.0和163 μg/L，其SSD擬合曲線如圖2(a)所示。即在中低質(zhì)量濃度藻類對重鉻酸鉀更靈敏。藻類對重鉻酸鉀的初始響應質(zhì)量濃度較低，當濃度大于458 μg/L時，藻類對氯化銅的敏感度比重鉻酸鉀要高。從全物種和藻類兩個角度考慮，氯化銅的敏感度均比較高。

重鉻酸鉀和五氯酚對水蚤的PNEC值分別為1.70和96.0 μg/L，其SSD擬合曲線如圖2(b)所示。水蚤對重鉻酸鉀更為靈敏。從全物種和水蚤兩個角度考慮，重鉻酸鉀的敏感度都是最高的。

氯化汞和3,4二氯苯胺對魚類的PNEC值分別為48.0 μg/L和1.89×103μg/L，其SSD擬合曲線如圖2(c)所示。魚類對氯化汞更為靈敏。由圖2可看到魚類對氯化汞的SSD曲線坡度明顯小于3,4二氯苯胺，即低質(zhì)量濃度時，魚類對氯化汞更敏感，但在高濃度時，則對3,4二氯苯胺更為敏感。從全物種和魚類兩個角度考慮，氯化汞的敏感度都是最高的。有研究表明，相同濃度下，重金屬化合物對生物的毒性比有機物要高[26]。這與本研究的結果相符。此外，在選擇陽性參照物時也應考慮待測樣品的性質(zhì)進行陽性參照物的選擇，當水樣中以重金屬為主要污染物時，可選用氯化汞作為陽性參照物；有機污染的水樣則可采用3,4二氯苯胺作為陽性參照物。

注：圖中C的單位為μg/L。

注：圖中C的單位為μg/L

4 結 論

(1)通過對常用于生態(tài)毒性檢測的7種陽性參照物的水生生物毒性數(shù)據(jù)的搜集、篩選及最終擬合，可知七類陽性參照物對于全物種和分物種的SSD曲線主要為BurrⅢ型和ReWeibull型，RePareto型曲線最少?；谌锓N分析，7種化合物的PNEC值大小順序為：苯酚>3,4二氯苯胺>硫酸鋅>五氯酚>重鉻酸鉀>氯化銅>氯化汞。

(2)通過全物種SSD曲線分析和每種水生生物毒性檢測所采用的生物種群分析，確定發(fā)光細菌毒性試驗、微藻生長抑制試驗、水蚤抑制運動試驗及魚類致死試驗的最優(yōu)陽性參照物分別為：硫酸鋅、氯化銅、重鉻酸鉀、氯化汞，其PNEC值分別為114.0、11.0、16.0、7.30 μg/L。

(3)比較重鉻酸鉀和氯化銅對藻類的SSD曲線，在低濃度時藻類對重鉻酸鉀較為敏感，高濃度時藻類對氯化銅的敏感度較高。對于重鉻酸鉀和五氯酚對水蚤的SSD曲線，水蚤對重鉻酸鉀始終最為靈敏。比較氯化汞和3,4二氯苯胺對魚類的SSD曲線，在低質(zhì)量濃度時，魚類對氯化汞更敏感，但是高濃度時，魚類對3,4二氯苯胺較為敏感。

(4)生態(tài)毒性檢測中陽性參照物的選擇仍需考慮水質(zhì)本身的特性，如待測定評價水中有機物較多，則優(yōu)先選擇有機物作為陽性參照物。