清腸溫中方對潰瘍性結腸炎模型大鼠炎性因子的影響*

石 磊 ，韓亞飛 ，賈博宜 ，郭 一 ，丁龐華 ，謝添泓 ，孫中美 ，原文靜 ，譚 祥 ，李軍祥

1北京中醫藥大學，北京 10029；2北京中醫藥大學東方醫院

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是屬于炎癥性腸病中最常見的一類疾病，好發于中青年，臨床主要癥狀為腹痛、腹瀉、排黏液膿血便，或伴隨多系統的腸外表現，此外還具有病程長、易復發等特點，給患者造成身體、心理、社會和經濟上的多重壓力，嚴重者甚至威脅生命。目前，UC的確切發病機制仍不明確，相關研究［1］認為與腸屏障損傷、腸道菌群失常、抗原識別和免疫應答的失常有關。其中，炎性細胞因子在UC的免疫發病機制中起到了重要作用，接導致組織損傷并影響其炎癥程度［2］。因此，研究藥物對炎性因子的具體作用，將會對UC的治療起到一定提示作用。前期研究發現，清腸溫中方可以明顯改善UC患者的臨床癥狀，降低疾病相關評分，促進鏡下黏膜修復［3］，并對 2，4，6- 三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitroBenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的腸炎大鼠腸黏膜有保護作用［4］。本研究試圖觀察清腸溫中方對TNBS誘導的UC大鼠炎性因子的影響，尋找清腸溫中方在UC中的可能作用靶點，為清腸溫中方的臨床使用提供更多的實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠70只，體質量(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002，飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，12 h/12 h：光照 / 黑夜循環，溫度(22±2)℃，濕度 50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 試藥與試劑 清腸溫中浸膏方(黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g等組成)由北京中醫藥大學中藥學院提供；烏梅丸(由烏梅16 g，干姜10 g，黃柏6 g，桂枝6g等組成)購自北京中醫藥大學東方醫院顆粒劑藥房；美沙拉秦緩釋顆粒(艾迪莎，中國上海愛的發制藥有限公司，國藥準字H20143164)；5%TNBS(w/v)(P2297)(美國 Sigma 公司)；無水乙醇、便潛血試劑盒(中農博信(北京)科技有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)(EK0526)、白介素 6(IL-6)(EK0412)、干擾素(IFN-γ)(EK0374)、白介素13(IL-13)(EK0900)酶聯免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；抗Occludin(ab31721)、抗 NF-κB p50(ab28849)抗體(美國Abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 SD大鼠適應性飼養1周，采用隨機數字表法將70只大鼠隨機分為空白組，模型組，清腸溫中方高劑量組(2.0 g浸膏/kg)、中劑量組(1.0 g浸膏/kg)、低劑量組(0.5 g浸膏/kg)，美沙拉秦組(400mg/kg)和烏梅丸組(8.4g生藥/kg)共7組，每組各10只。采用TNBS/無水乙醇改良復合法復制UC模型［4］。除空白組外，所有大鼠禁食不禁水12小時，10%水合氯醛(0.003mL/g)腹腔注射以麻醉大鼠，將石蠟油浸潤嬰兒灌腸管10 cm圓頭，由肛門緩慢插入8 cm，將終濃度33.3%無水乙醇的TNBS(100 mg/kg)溶液0.6 mL1分鐘內一次性緩慢推注入內，每只大鼠使用新灌腸管。保持仰臥位15分鐘后，放回籠內棉花保暖至清醒。第4天起所有大鼠行常規飲食，同時連續10天給予相應藥物灌胃干預(0.01 mL/g)，模型組用蒸餾水進行對照。實驗期間每天記錄大鼠體質量，觀察一般情況和便質，化驗便潛血。

1.3.2 標本采集處理 實驗結束時以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，采血管靜置2小時后，4℃離心15分鐘(3 000 rpm)分離血清，分裝后-80℃冷凍備用；分離遠端結腸(距肛門10 cm)2 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片包埋，4 μm切片，抗原修復后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察核轉錄因子κB(NF-κB)p50蛋白表達。

1.3.3 疾病活動指數(Disease Activity Index，DAI)［5］體質量下降率：無下降 0 分；1%～5%記 1 分；5%～10%記 2 分；10%～15%記 3 分；大于 15%記 4 分。便質：正常0分，稀軟便2分；水樣便4分；便潛血：陰性0分；陽性2分；肉眼血便4分。DAI評分為3項評分的平均值。

1.3.4 免疫組化結果陽性表達 采用Image J軟件(1.37c NIH，USA)對染色結果進行分析，用平均光密度值(AOD=IntDen/Area)表示目標蛋白染色強度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用(±s)描述，用單因素方差分析進行檢驗，方差齊用LSD-t，不齊用Tamhane′s T2。不符合正態分布的計量資料及計數資料用中位數、p25和p75描述，用獨立樣本非參數檢驗的K-W檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清炎性因子 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6及IFN-γ與空白組比較明顯升高，經藥物干預治療后的大鼠血清含量均有所下降，其中以中劑量和美沙拉秦組下降最為明顯。模型組血清IL-13含量比空白組明顯降低，經藥物治療后，各組含量均明顯增多。見表1。

表1 各組血清炎性因子含量比較(±s) pg/mL

表1 各組血清炎性因子含量比較(±s) pg/mL

注：＊表示與空白組比較，P＜0.01；#表示與模型組比較，P＜0.01；##表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 TNF-α IL-6 IFN-γ IL-13空白組 10 67.53±14.88 90.49±5.08 21.64±2.46 44.49±7.15模型組 6 98.38±23.06＊ 181.39±58.67＊ 69.12±10.26＊ 21.01±4.87＊高劑量組 7 79.97±6.05 117.65±32.21## 39.86±5.70## 35.80±3.61#中劑量組 8 73.93±10.04## 99.93±19.50# 26.61±6.47# 40.31±5.79#低劑量組 7 79.59±21.52 154.30±80.55 50.06±6.95 34.92±2.60#美沙拉秦組 8 73.01±5.33## 92.73±14.10# 23.49±2.27# 42.15±1.46#烏梅丸組 8 78.38±16.44## 115.02±27.52## 34.89±4.69## 39.68±2.82#

2.2 D A I及一般情況 造模過程中，空白組大鼠表現正常，造模大鼠出現活動度下降、進食飲水量減少、喜蜷縮靜臥，毛發缺乏光澤、大便稀軟甚至出現黏液狀糞便等表現并逐漸加重。造模期間除空白組外，每組均死亡1只大鼠。用藥干預期間，模型組大鼠一般狀態仍然較差，進食量和體質量持續下降，部分大鼠一直存在便潛血陽性甚至可見肉眼血便，治療期間死亡3只。其余大鼠整體狀態均有所好轉，隨著藥物干預，進食和體質量均逐漸增加，部分大鼠在治療結束前便潛血可轉陰性。治療期間，高劑量、低劑量組各死亡2只，中劑量、美沙拉秦組和烏梅丸組各死亡1只。最后1天DAI結果提示，與空白組相比，模型組評分顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較，清腸溫中方中劑量、美沙拉秦和烏梅丸組評分下降(P＜0.05)。見圖1。

圖1 DAI評分圖

2.3 N F-κBp50 免疫組化染色后發現，UC模型組大鼠腸道NF-κB p50表達量明顯高于空白組(P＜0.01)，陽性蛋白的表達范圍和染色強度均明顯升高。與模型組比較，清腸溫中方中劑量、美沙拉秦組和烏梅丸組，其陽性蛋白表達均有明顯下調(P＜0.01)。蛋白表達含量見圖2，免疫組化染色見圖3。

圖2 NF-κB p50蛋白表達含量差異圖

圖3 NF-κB p50蛋白免疫組化染色圖(x200)

3 討論

本實驗采用TNBS/無水乙醇復合法建立UC模型，前期我們已經發現TNBS/無水乙醇復合法可以成功誘導大鼠實驗性腸炎［6］。UC的發病機制中，異常活化的免疫應答一直是研究的熱點。其免疫學紊亂的特征在于：1)腸上皮損傷，包括黏液的異常生成和修復機制缺陷；2)由腸道菌群驅使的炎癥擴大和大量的細胞浸潤到固有層中；3)控制炎癥反應的免疫調節失常，使炎癥級聯反應進一步加大。因此，細胞因子在腸道炎癥的起始、介導、持續、控制和組織損傷方面不容忽視，而轉錄因子NF-κB的異常活化就會引起炎性因子的大量激活和釋放，引起一系列過激的免疫應答和炎癥反應［7］。

生理情況下，細胞質中的NF-κB與抑制蛋白IκB以無活性的復合物形式存在于細胞中。內在膜受體的介導會使一些胞外信號激活IκB激酶，使IκB磷酸化而發生解離，導致NF-κB活化；活化的 NF-κB 會參與 TNF-α、誘生型 NO、IL-1β、血管細胞黏附分子-1、IL-6、IL-8等多種炎癥因子或介質的分泌，而這些細胞因子與UC的各個階段密切相關［8］。本實驗通過免疫組化染色發現：模型組大鼠結腸黏膜層NF-κB p50表達明顯增多，這可能與NF-κB的異常激活有關，而后者的激活會直接導致促炎因子、IFN-γ等表達上調，同時又直接參與到了TNF-α信號通路。

TNF-α通過旁分泌和自分泌形式在UC腸黏膜局部發揮作用，一方面活化內皮細胞表面整聯素的表達、募集中性粒細胞、誘導NO合酶異構體產生大量NO直接損傷細胞；另一方面與IFN-γ共同作用于腸屏障，破壞腸屏障完整，增加其通透性。此外也能促使IL-6等炎性因子的釋放，后者通過STAT-3途徑進一步激活NF-κB誘導黏附因子等的表達［9］。而IL-13作為具有抗炎效應的一種Th2細胞因子，能從轉錄水平對G-CSF產生抑制，調節中性粒細胞的存活、增生和分化，并能增強成熟中性粒細胞功能，在抗感染的細胞免疫中起重要作用［10］。

清腸溫中方是北京中醫藥大學東方醫院李軍祥教授總結多年臨床的經驗方，在UC治療中取得了很好的效果。李教授認為UC活動期屬于中醫的“腸澼”范疇，此病病位在腸，與脾胃關系密切；病性為本虛標實，寒熱錯雜；本虛為脾虛、脾陽不足，標實為濕熱內蘊，夾有瘀血。治療當以清腸溫中、化瘀止血，用于寒熱錯雜，濕熱瘀阻證。癥見腹瀉黏液膿血便，腹部冷痛，里急后重，口干口苦，小便短赤，肛門灼熱，苔黃厚膩，脈滑數或濡數。該方主要由黃連、炮姜、三七、木香等組成。研究顯示木香能夠下調大鼠血漿中前列腺素E2表達水平，而抑制炎性細胞，減輕腸道炎癥，通過啟動UC腸黏膜組織的防御機制，從而增強結腸黏膜屏障的防御機能［11］。黃連的主要成分黃連素可以通過抑制IL-6/STAT3信號通路而起到了緩解癥狀、減輕炎癥程度的治療作用［12］。而炮姜的有效成分6-姜酚對脾胃虛寒模型大鼠具有顯著的溫中散寒作用。本實驗發現，模型組大鼠以上促炎因子表達都明顯高于空白組，而當藥物治療后，表達都能有所下降；因此推測炎性因子可能是清腸溫中方治療UC的作用靶點之一。清腸溫中方可能通過抑制TNF-α分泌激活和NF-κB的轉錄，減少了IFN-γ、IL-6等促炎因子表達，并上調IL-13這類抗炎因子，從而通過減輕和維持正常炎癥反應，起到治療UC的作用。此外我們還發現，清腸溫中方中劑量和美沙拉秦組在所有藥物治療組中，對炎性因子的作用最為明顯，這也為清腸溫中方的使用劑量和有效性提供了一定的實驗室數據支持。但本實驗樣本例數較少，有待進一步研究。

綜上所述，促炎因子相互間作用形成網絡，而抗炎因子的表達受抑制，使整體上擴大了炎癥級聯反應，導致UC的發生。