防治植物病原菌的植物提取物制劑

韓 悠 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

植物次生代謝會合成多種生物活性物質以抗御害蟲、病原菌以及抑制其他植物生長。精油和植物提取物中含有生物堿、氰苷、萜類、多炔類(polyacelylenes)和聚噻吩類(polythienyls)等眾多生物活性物質。研究人員探討了這些分子的多樣性及其在害蟲和病原菌綜合治理中的應用。基于植物提取物和精油的產品在許多國家都可用于防治植物病害。然而，盡管農藥市場對植物制劑的需求量巨大，特別是對環保治理農業害蟲的需求日益高漲，但植物源制劑的數量仍然有限。

植物病理學研究最常見的情形是，利用粗產物狀態的提取物和精油防治真菌、細菌和線蟲。在受控條件下，不同植物的提取物和精油對植物病原菌有抑制作用。但通常極難在大田觀察到如實驗室或溫室試驗取得的良好結果。田間條件下生物活性物質的降解和揮發是造成植物源產品功效下降的主要因素。因此，由于生物活性物質的損失，致使某些用于農業的植物材料的潛在適用性最終被低估了。避免這些弊端的選擇之一是使用聚合物、增塑劑、穩定劑和可生物降解的抗氧化劑來制備生物活性植物產品。

根據制劑類型，使用聚合物、乳化劑、表面活性劑、溶劑、穩定劑、消泡劑和其他成分以確保生物活性化合物的穩定性、黏附性和緩釋性。含植物活性成分的緩釋液體和固體制劑的例子在醫藥、制藥、食品技術和美容業等一些領域很常見。在農業領域，盡管這些技術是治理種子、土壤傳播和獲后病原菌的令人關注的選擇，但緩釋劑的應用還處于初級階段。在這種制劑中，活性成分隨著時間的推移被釋放到環境中，這一特性具有減少活性成分的損失，延長持效期以及減少對動植物的毒性的優點。

根據用于包封(encapsulation)的方法和材料，制備工藝大有不同，但重要的是制備植物源提取物制劑用于試驗，而不是使用它們粗產物。Darlan Ferreira Borges等探討了植物提取物、精油及其分離的活性化合物制劑對植物病原菌的應用潛力，提出了制備可用于植物病理學研究和相關領域的制劑的方案。

圖1 噴霧干燥形成顆粒

1 包封的主要方法

1.1 霧化法(噴霧干燥)

這一工藝包括3個步驟：首先，將產品(如提取物和精油)以液滴的形式分散，從而增加了產品的表面積。第二，分散的液滴與加熱的氣流接觸，第三，溶劑被蒸發，形成固體顆粒(圖1)。這在工業化中屬低成本工藝，特別是精油的微囊化。

噴霧干燥法制備的制劑對植物病原體的防治至今尚未進行廣泛探究。僅有少數幾例，如咖啡葉提取物或沒食子酸的制劑被用作植物抗性誘導劑或用于防治紫丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)。

1.2 凍干法(冷凍干燥)

在冷凍干燥過程中，產品(提取物或油)被迅速冷凍，從而保持其化學特性。在接下來的步驟中，冷凍的材料進行局部真空處理。然后，通過升華將冰或其他冷凍溶劑從材料中除去，將產品干燥至約2%濕基。粉碎脫水后的固體物料至所需粒度。

一些植物的凍干提取物具有殺菌活性。蕓香(Ruta graveolens)的凍干提取物能抑制植物病原真菌鏈孢菌(Fusarium solani)、番茄棘殼孢(Pyrenochaeta lycopersici)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)和青霉菌的菌絲生長。而天竺葵(Pelargonium sp.)、鼠尾草(Salvia officinalis)、薰衣草(Lavandula officinalis)、唇萼薄荷(Mentha pulegium)和亞洲薄荷(Mentha arvensis)的凍干提取物則可使大豆銹病病菌(Phakopsora pachyrhizi)的孢子萌發率降低85%。

1.3 脂質體包裹法(乳劑)

乳劑的定義為含有至少2種不可混溶的液相的熱力學不穩定體系，其中一相含有的膠體顆粒分散于另一相中。納米乳(nanoemulsions)是研究最多的乳劑類型。它們為無色微乳液，液滴大小為50～200 nm，而常規乳劑呈現大小為1～1 00 μm的藍色液滴。與常規乳劑相比，納米乳具有更高的動力學和熱力學穩定性，更易于擴散和納米顆粒轉運，強化了對親水或親脂分子在其分散相中的摻入和保護。例如，對納米乳液微囊化所制得的產品，有利于植物化學物質跨細胞膜的轉運。

精油和植物提取物的乳劑是防治植物病害值得推薦的方法。例如，肉桂、檸檬和佛手柑精油納米膠囊對黑曲霉(Aspergillus niger)具有抗菌活性。其他值得注意的例子有玫瑰草(palmarosa)精油納米乳可抑制草莓黃單胞菌(Xanthomonas fragariae)，印楝(Azadirachta indica A. Juss)和亞香茅[Cymbopogon nardus(L)Rendle]精油納米乳可抑制立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)。

1.4 擠壓-澆鑄法

在該方法中，將乳液/提取物芯和涂層材料(海藻酸鈉、乙酸鹽、淀粉等)通過移液管或噴嘴在高壓下加入某離子溶液中，如氯化鈣溶液，邊加邊攪拌。20 min后收集凝膠微球并干燥。微球壁的阻力取決于制劑的組分和顆粒與離子溶液的吸附時間。必須注意盡量減少或避免在包封過程和儲存期間活性化合物損失。

擠壓包封的植物提取物和精油可用于食品保藏，例如輕度加工的蘋果和蘑菇。然而，利用這種技術對防治植物病害的植物源提取物的制劑技術并未進行系統研究。

1.5 流化床法

流化床涂層即在流化粉末床上噴涂包封劑。被包封的物料在特定溫度下以固態懸浮于煤氣體流，噴涂液體包封材料的霧滴，在物料顆粒上形成一層薄液膜。最后，材料經潤濕和干燥形成一牢固的均質層。物料循環速率、噴嘴霧化壓力、濕度和涂層溫度都會影響涂層的效率。流化床法廣泛應用于制藥和食品工業，也可用于合成農藥、染料和其他工業化學品。

與噴霧干燥法相比，此技術制備的顆粒活性化合物含量更高，流動性更好，涂覆率更高。有望使用該工藝制備用于防治土壤傳播病原體的緩釋劑產品。這種方法的另一個優點是，除了具有高度的可控性和自動化之外，還可以進行大批量應用，即顆粒循環時間短，熱傳輸量大。?migielski等人(2011年)觀察到薰衣草(L. angustifolia)精油在干燥過程中損失率超過40%。然而，如果在具干燥劑和熱交換器的密閉循環系統中，通過流化床干燥植物的鮮生物量，所得產物中的揮發性和生物活性的物質將比其他工藝方法含量更高。

1.6 凝聚法

凝聚法是按3個步驟進行包封的一種方法：制備乳液、微囊化包封和固化。表面活性劑，如吐溫80，用于乳液制備。單寧酸、甘油或戊二醛可用于固化工藝。一些生物高聚物被用于包封、保護和釋放親脂性化合物，主要有大豆蛋白/阿拉伯樹膠、明膠/阿拉伯樹膠和明膠/果膠。凝聚法技術成本低廉，最適合用于油性化合物和精油的微囊化。

以復合凝聚法制備的波爾多樹(Peumus boldus Mol.)精油微膠囊處理花生種子，在長達114 d貯存期內對青霉菌和曲霉菌具有極佳的防效。據報道，有人還用凝聚法包封芥菜精油，其物化性質穩定并具較強的抗菌作用。

1.7 分子包合法

分子包合物通常是特殊的化合物，其中一個組分的分子，稱為客體分子(guest molecules)，被完全或部分地包在另一個組分即主體分子(host molecule)的空腔中。環糊精是最常用的主體分子，這些復合物的結構取決于其空腔的性質。

圖2 海藻酸鹽(alginate)和鈣的三維網(“蛋盒模型”)

環糊精是淀粉在環糊精酶糖基轉移酶作用下生成的環狀寡糖。環糊精的外緣為親水性，內腔為疏水性。因此，一旦有一個客體分子適合這個空腔，就會形成一個包合物。因此，有機分子和無機分子可以包封起來，從而改變客體分子的溶解性和穩定性。與環糊精分子包合的主要優點是增加了化合物在水中的溶解性，這是包封精油的一個理想特性。

近年來，環糊精分子包合物已被應用于包封防治植物病原物的活性化合物，尤其是真菌。丁香酚β-環糊精包合物微膠囊對荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)有較好的防治效果。丁香精油和牛至精油 β-環糊精微膠囊對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的菌絲生長也有抑制作用。另一方面，苯丙素類化合物用環糊精包封時能更有效地抑制尖孢鐮刀菌和灰霉病菌的生長。可用一些假設解釋這一結果，比如真菌可利用包合物作為碳水化合物的來源，或者由真菌自身生成的殼體物也可自主抑制菌絲的生長。

2 主要的包封材料

2.1 海藻酸鹽

海藻酸鹽是甘露糖醛酸的線型共聚物，其 C-5差向異構體為古羅糖醛酸，分子式(C6H8O6)n。它存在于海藻和某些細菌中。該物質根據甘露糖醛(M)與古羅糖醛酸(G)的比例以及其序列結構和聚合度不同差別很大。因此，該物質可以呈現為M-G殘基和由2個或2個以上M-G殘基組成的嵌段(blocks)的交替序列。

海藻酸鹽是一種可生物降解的聚合物，在Ca2+和Mg2+等二價陽離子存在時會形成三維凝膠。鈣離子與海藻酸鹽鏈中的古羅糖醛酸嵌段結合，形成一個三維網(圖2)。這種特性使海藻酸鹽成為包封生物活性化合物的理想材料，包括植物病理研究關注的化合物。

例如，海藻酸鈉可用于從植物中提取的酚類化合物的制備，確保保留此類物質80%以上功效。用海藻酸鈣微球包封植物提取物、精油和生防劑可延長活性化合物或拮抗微生物的有效性。

2.2 殼聚糖

殼聚糖是幾丁質脫乙酰化所得的一種陽離子氨基多糖，是昆蟲和甲殼類動物外骨骼中含量最高的部分。殼聚糖的結構由β (1-4)2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(或 D-氨基葡萄糖)重復單元構成，分子式為(C6H11O4N)n。殼聚糖可用作多種包封方法的成分，如凝聚、乳液和擠壓。當殼聚糖納米凝膠(Chitosannanogels)在水中分散時具有生物相容性和穩定性，有利于納米膠囊的處理。

肉桂粉和肉桂提取物與殼聚糖的混合物對立枯絲核菌和南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)具有一定的離體防治潛力，但還未在田間對此進行研究。在室內試驗中，巴柑檬(Citrus bergamia)和酸橙(Citrus aurantium)精油殼聚糖膠囊可抑制黃曲霉(Aspergillus flavus)的生長。

2.3 乙酸纖維素

纖維素是地球上最豐富的天然高分子。由于纖維素的熔點較低，通常將其轉化為其衍生物，使之更易于加工。乙酸纖維素(CA)、丙酸纖維素和丁酸纖維素等一些纖維素衍生熱塑性酯類即是如此。

乙酸纖維素是木纖維與醋酐和乙酸反應生成的一種酯。這個反應在硫酸存在的條件下發生。產物隨后被水解以除去酸、硫酸基和乙酸，直到獲得所需的性質。乙酸纖維素粗纖維是由乙酸纖維素薄片物理轉化而來，即乙酸纖維素在丙酮中溶解，隨后在粗纖維中膨脹。乙酸纖維素可以較大范圍的取代度(DS)生成。但由于必須得到具有適當摩爾質量、熔化溫度和適當溶解度的產品，最常見的是生產DS為2.5的乙酸纖維素。當DS＞2.5時，使用二氯甲烷作為溶劑。

乙酸纖維素膜可包含植物提取物和精油。根據膜的特性，可向乙酸纖維素中添加增塑劑，如鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、檸檬酸三乙酯(TEC)和丙三醇。Pola等人(2016)開發了含牛至油和蒙脫石黏土精油的乙酸纖維素膜，用于防治采后病原菌鏈格孢菌(Alternaria alternata)和匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)。這些膜通過可直接接觸和釋放活性揮發性化合物發揮抗真菌作用。

2.4 淀粉

淀粉是以顆粒形式儲存的植物貯存多糖。它價廉易得，來源廣泛，如玉米、大米、木薯、小麥等。淀粉的結構單元為 α-D-(1,4)糖苷鍵連接的脫水葡萄糖。它由2個同聚物組分組成：直鏈淀粉(15%～30%)和支鏈淀粉(85%～70%)。在植物病理學研究中，淀粉基膜可用于獲后水果貯藏，可能含有植物提取物、水楊酸和精油。

淀粉在薄膜生產中的應用，是基于直鏈淀粉形成凝膠的化學、物理和功能特性及其成膜的性能。由于其線性，溶液中的直鏈淀粉分子往往平行排列，從而在相鄰聚合鏈的羥基間形成氫鍵。因此, 聚合物對水的親和性降低了，這有利于形成不透明的糊狀物和牢固的薄膜。直鏈淀粉在淀粉中占比高會形成更堅固、更有彈性的薄膜，由于支鏈淀粉的支鏈結構則一般形成機械性能較差的薄膜。

傳統上，淀粉基膜是由澆鑄法產生，因為天然形式的淀粉的熔點高于其分解溫度。在這種方法中，將淀粉溶于溶劑中，所得成膜劑溶液(filmogenic solution)在干凈平整的表面應用。溶液于 25～30 ℃放置蒸發溶劑。Dias (2010)報道了一種用澆鑄法制備大米淀粉和米粉薄膜的技術。簡而言之，生淀粉(raw starch)或面粉水溶液(質量體積比為5%)以4 000 rpm攪拌15 min。向水溶液中添加增塑劑(丙三醇或山梨醇)，濃度為0.20 g/g或0.30 g/g干生淀粉或面粉。隨后，將混合物加熱至85 ℃，期間連續攪拌1 h，均勻地倒在有機玻璃板上，置于鼓風烘箱中于30 ℃烘干 14 h。為制備米粉膜, 將水溶液的 pH 值調至10.0，以促進蛋白質溶解。

膜中添加增塑劑可提高其彈性、加工性和延展性。最常用的增塑劑是丙三醇和山梨醇。丙三醇是一種具易與淀粉鏈相互作用的羥基基團的親水性小分子。當希望降低淀粉膜的親水性時，脂肪酸和精油也可用作增塑劑。

淀粉膜在具有效水的環境中可迅速生物降解。在共混物中加入其他更穩定的組分能延緩淀粉膜的降解。淀粉共混物可以用殼聚糖、聚乳酸(PLA)生產；聚對苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBAT)和聚丁二酸丁二醇-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)。

2.5 聚己內酯和聚對苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物

聚己內酯(PCL)是一種對活性化合物具有高滲透性的可生物降解的合成聚合物。PCL為半結晶聚合物，玻璃化轉變溫度為?60 ℃，熔點為59～64 ℃。PCL確保了制劑的穩定性，提高了耐應力開裂的能力，增強了緩釋性。Lippia sidoides(一種富含百里香酚的植物)精油PCL納米膠囊可在5 ℃下穩定保存60 d。可將丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、聚乳酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic acid-co-glycolic acid)與PCL混合，以改善制劑特性。

聚對苯二甲酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物是以丁烷-1,4-二醇、己二酸和對苯二甲酸為原料合成的一種共聚酯。雖然它來自石油，但它可在幾個星期內完全生物降解。PBAT膜具有良好的加工性、高彈性、疏水性以及優異的機械和阻隔性。它比其他聚合物價格昂貴。但PBAT與低成本的生物聚合物的混合物可生產具有良好機械和阻隔性的價廉、可生物降解的膜。

3 結 語

植物合成了一系列可用于防治植物病原菌的化合物。由于許多國家植物物種的多樣性，特別是位于熱帶和亞熱帶地區，若干對植物病原物有抑制作用的物質目前還尚未被人類發現。由于這些物質在田間試驗中效果較差，許多前景看好的植物源物質的潛力被低估了。植物提取物和精油制劑可以減少生物活性化合物的損失，許多植物源產品可用作防治植物病害的替代藥劑。在植物病理學的研究中，很少對植物源物質制劑的生物活性進行探討。如上所述，可根據試驗目的制備一些低成本的制劑，減少生物活性化合物的損失。要將有潛力的植物材料開發成商業化產品取決于多種因素，如操作工藝和經濟狀況。納米材料和納米技術為新穎植物源產品的開發提供了前所未有的可能性。因此，必須鼓勵植物病理學家使用制備的植物源物質制劑，而不是它們的粗產物，這樣可能會增加植物病害環境友好型防治方案數量。