果樹根結(jié)線蟲抗性鑒定方法探討

喬峰，王敬民，李敬華，程棟，劉艷紅，石瑜

（淄博市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東淄博255000）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）能夠侵染熱帶和溫帶植物的根系，是世界上對(duì)植物破壞性最大的病原體之一[1]。由于溫室多年連作或購(gòu)買帶線蟲苗木等原因，使溫室土壤中根結(jié)線蟲增多，嚴(yán)重危害了蔬菜、果樹等經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上比較認(rèn)可的防治方法是栽培持續(xù)高抗的蔬菜、果樹品種。因此，在果樹育種過(guò)程中需要一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定抗性品種方法，本文介紹了不同的接種源和不同接種源的獲取方法，以及它們對(duì)根結(jié)線蟲抗性篩選的影響和常用的抗性鑒定方式，如一般接種、高持續(xù)性接種等。分析了適用于果樹的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)接種，并指出抗線蟲植株鑒定篩選的趨勢(shì)是向快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記方向發(fā)展。

1 接種源及其獲取方法對(duì)根結(jié)線蟲抗性篩選的影響

一般根結(jié)線蟲的接種源分為卵塊、卵、二齡幼蟲，由于卵塊的收集時(shí)間較長(zhǎng)，且每個(gè)卵塊中卵的數(shù)量不同，較難形成統(tǒng)一的接種標(biāo)準(zhǔn)；接種時(shí)，卵塊為塊狀，不易均勻分散在果樹根系周圍；另外，其他病原體和根腐病菌易通過(guò)卵塊侵染植物，引起病害。接種二齡幼蟲時(shí)，要確保獲得接種源后及時(shí)接種，以防止幼蟲死亡或侵染力下降；同時(shí)，需保證二齡幼蟲適宜的生存環(huán)境，防止二齡幼蟲死亡或侵染力下降。卵的獲取較方便快捷，可通過(guò)NaClO溶液沖洗獲得[2]；獲取過(guò)程中，卵的表面得到消毒，不會(huì)攜帶病原體；接種時(shí)，通過(guò)制定一定濃度的懸浮液，保證統(tǒng)一接種量，且可均勻侵染果樹根系。

不同的接種源獲取方法對(duì)抵抗根結(jié)線蟲的侵染有一定的影響。根據(jù)Hussey 1973的報(bào)道，用離心機(jī)或機(jī)械粉碎獲得卵的方法對(duì)其孵化和侵染力都有一定的破壞作用，如卵的孵化率降低和卵的數(shù)量減少[2]；在潮濕環(huán)境中，孵化的根結(jié)線蟲侵染率更低。用1.05%NaClO溶液沖洗[2]獲得卵的方法對(duì)其孵化和侵染力影響較小，并證明用1.05%NaClO溶液沖洗收集到的卵作為接種源最合適。

2 鑒定方式

2.1 接種方式

2.1.1 一般的接種方法

在鑒定篩選抗性果樹植株時(shí)，常用含有一定數(shù)量的二齡幼蟲懸浮液接種。通過(guò)控制每株接種二齡幼蟲懸浮液的濃度和體積控制接種量。具體操作方法如下：用移液槍在距離植株莖基部1cm左右，注射到2cm深的小孔中[3]，7d后觀察植株根系的變化，包括根結(jié)數(shù)量、根結(jié)指數(shù)，或30d左右測(cè)定每株根系中卵、二齡幼蟲或雌蟲數(shù)量（線蟲的數(shù)量可通過(guò)酸性品紅染色的方法計(jì)數(shù)），從而確定植株的抗性級(jí)別。木本植物中，常用根結(jié)指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]（表1），在分級(jí)的基礎(chǔ)上，計(jì)算病情指數(shù)并確定抗性級(jí)別。該方法簡(jiǎn)便、快速，接種量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，但在篩選抗性果樹植株中不容易區(qū)分出高抗植株。

表1 抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standard of resistance

2.1.2 高持續(xù)性接種

高持續(xù)性接種能夠明顯區(qū)分出高抗植株，通過(guò)連續(xù)大量的對(duì)篩選植株接種，獲得的抗性植株較準(zhǔn)確。具體操作如下：在接種前，培育大量感病的番茄苗，當(dāng)番茄長(zhǎng)到5葉齡時(shí)，接種500條二齡幼蟲；2個(gè)月后，部分番茄苗去掉地上部分，把其根系和土壤整體移到被鑒定植株的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，一段時(shí)間后，測(cè)定根結(jié)數(shù)等指標(biāo)；剩余番茄苗作對(duì)照，去掉地上部分，每隔一段時(shí)間測(cè)定土壤和番茄根系內(nèi)線蟲和卵的數(shù)量，從而確定各個(gè)時(shí)期的接種量[5]。高持續(xù)性接種保證了接種根結(jié)線蟲的持續(xù)性，能夠較好地區(qū)分高抗植株，但接種數(shù)量不易被確定或不準(zhǔn)確。

2.2 離體抗性鑒定及其改進(jìn)

2.2.1 離體抗性鑒定

果樹根系生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)，如果用常規(guī)育苗方式，如綠枝扦插、硬枝扦插等，一年中只能繁育2～3批鑒定的果樹苗木，嚴(yán)重影響植物抗性鑒定的進(jìn)度。組織培養(yǎng)育苗能夠?qū)崿F(xiàn)周年育苗，確保為抗根結(jié)線蟲的鑒定提供充足植株。組織培養(yǎng)育苗后，通過(guò)煉苗移栽然后鑒定其抗性，或直接在培養(yǎng)基中接種根結(jié)線蟲鑒定其抗性。

組織培養(yǎng)育苗鑒定根結(jié)線蟲抗性時(shí)，需確定外源生長(zhǎng)素是否對(duì)組織培養(yǎng)獲得的植株產(chǎn)生抗性修飾，導(dǎo)致其抗性消失或增強(qiáng)。有文章已報(bào)道桃樹在組織培養(yǎng)過(guò)程中受外源萘甲酸的影響，其抗性降低[6]，但Esmenjaud等[5]證明通過(guò)組織培養(yǎng)獲得的紫葉李對(duì)根結(jié)線蟲的抗性不受外源激素影響。因此，在利用組織培養(yǎng)擴(kuò)繁抗性鑒定植株時(shí)，需要鑒定生長(zhǎng)素及其不同濃度對(duì)擴(kuò)繁植株抗性的影響，才能鑒定其抗性。結(jié)合組織培養(yǎng)的方式鑒定植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性，能夠縮短鑒定時(shí)間，且在一年內(nèi)可多次育苗，實(shí)現(xiàn)多次鑒定。

2.2.2 培養(yǎng)基內(nèi)抗性鑒定

在土壤中很難觀察果樹根系對(duì)根結(jié)線蟲的抗性程度，且不能直接觀察根結(jié)線蟲的侵染過(guò)程。培養(yǎng)基內(nèi)鑒定植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性能夠觀察到根結(jié)線蟲的侵染過(guò)程及發(fā)病情況，但需要排除外源激素、培養(yǎng)基等因素的影響，并且植株能夠快速生長(zhǎng)出大量根系。1991年，Sijmons等人[7]在培養(yǎng)基中鑒定植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性以及觀察根結(jié)線蟲的侵染過(guò)程，篩選出易被根結(jié)線蟲侵染的擬南芥和適宜根結(jié)線蟲侵染的培養(yǎng)基，確定了生根培養(yǎng)基—Knop（1860）對(duì)根結(jié)線蟲的侵染不會(huì)產(chǎn)生影響，并證明蔗糖的濃度及質(zhì)量和培養(yǎng)基的硬度都會(huì)影響到根結(jié)線蟲的侵染效率。利用擬南芥根系細(xì)并且透明的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中能夠觀察到根結(jié)線蟲的侵染和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。該方法證實(shí)在培養(yǎng)基內(nèi)鑒定植株對(duì)根結(jié)線蟲抗性和觀察根結(jié)線蟲在植株根系中生長(zhǎng)發(fā)育的可行性，表明在室內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)一年多次對(duì)植株根結(jié)線蟲抗性的鑒定。

果樹植株生根較慢，可通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌促進(jìn)植株在培養(yǎng)基內(nèi)快速生根[8]，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)快速鑒定。2006年，Alpizar等[9]向咖啡樹中轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，促使植株快速生長(zhǎng)出大量毛狀根，鑒定其對(duì)根結(jié)線蟲的抗性，證明發(fā)根農(nóng)桿菌不會(huì)改變植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。2011年，Bosselut等[10]鑒定紫葉李對(duì)根結(jié)線蟲抗性時(shí)，也通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染紫葉李促使其發(fā)根并在培養(yǎng)基中接種根結(jié)線蟲，鑒定其抗性。以上試驗(yàn)說(shuō)明發(fā)根農(nóng)桿菌能夠促進(jìn)組培苗生根且不影響植株對(duì)根結(jié)線蟲的抗性鑒定。

3 小結(jié)

抗根結(jié)線蟲植株的篩選是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，篩選植株的方法已經(jīng)從田間鑒定發(fā)展到試驗(yàn)室內(nèi)，但也需要準(zhǔn)確的抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。抗性的評(píng)定指標(biāo)很多，如根結(jié)指數(shù)、每克根中雌線蟲數(shù)、二齡幼蟲數(shù)、卵數(shù)和總的線蟲數(shù)量等，這些指標(biāo)均是形態(tài)學(xué)上的分析評(píng)定，對(duì)極抗病植株和極感病植株的判斷較準(zhǔn)確，但是對(duì)中間類型的判斷比較模糊。考慮到從育苗到接種，再到抗性評(píng)價(jià)整個(gè)過(guò)程的繁瑣性，需要從分子層面準(zhǔn)確的鑒定植株抗性。相信隨著分子技術(shù)地不斷發(fā)展與成熟，以及抗性基因的發(fā)現(xiàn)，從分子方面快速準(zhǔn)確的鑒定抗性是一種發(fā)展趨勢(shì)。