左旋肉堿的分析方法

楊曉惠　鄭俠　夏玉

[摘要]左旋肉堿是參與生物體新陳代謝的重要物質(zhì)，具有多種生理功能，而左旋肉堿的含量是衡量其品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前，各研究學(xué)者已經(jīng)開發(fā)了多種分析方法對(duì)左旋肉堿的含量進(jìn)行測(cè)定，主要包括酶技術(shù)法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）和質(zhì)譜法（MS），但這些研究基本上都是實(shí)驗(yàn)性研究，缺少對(duì)于這些測(cè)定方法的歸納和總結(jié)。基于此，為了便于檢驗(yàn)人員操作及選擇，文章對(duì)近年來(lái)左旋肉堿的分析方法進(jìn)行歸納總結(jié)，也為其他學(xué)者的進(jìn)一步研究提供參考。

[關(guān)鍵詞]左旋肉堿；測(cè)定方法；酶技術(shù)法；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180207

左旋肉堿（L-carnitine），又稱L-肉堿、左卡尼汀、L-肉毒堿或維生素BT，化學(xué)名為β-羥基γ-三甲銨丁酸，分子式為C₇H₁₅NO₃。是1905年由兩位俄國(guó)科學(xué)家Gulewitsch和Krimberg在肌肉浸汁中發(fā)現(xiàn)的一種類維生素。

肉堿有左旋（L-廣型）和右旋（D-型）兩種異構(gòu)體。其中只有L-型具有生理活性，而D-型是人工合成物，自然界中不存在，不僅沒有生物活性，而且還對(duì)L-肉堿有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。通常肉堿所指都是左旋肉堿。

左旋肉堿的來(lái)源有兩種：第一，體內(nèi)合成（主要是肝臟和腎臟），第二，膳食攝取（主要是動(dòng)物性食物）。其主要生理功能是作為載體將長(zhǎng)鏈脂肪酸從線粒體膜外輸送到膜內(nèi)促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，從而促進(jìn)機(jī)體脂肪代謝。此外，左旋肉堿還可以抗疲勞；緩解腎衰透析引起的急、慢性并發(fā)癥；改善代謝綜合征的腹部肥胖、血脂異常等臨床癥狀；參與精子運(yùn)動(dòng)和成熟過(guò)程等。

根據(jù)上述生理功能，加之食用安全、性質(zhì)穩(wěn)定，近年來(lái)，左旋肉堿作為一種新型營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和功能食品原料在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。包括減肥、健美等保健食品；嬰兒食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑；運(yùn)動(dòng)員、中老年人的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、化妝品，此外，左旋肉堿在飼料和醫(yī)療藥物方面也有應(yīng)用。由此可見，左旋肉堿具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前，左旋肉堿的檢測(cè)方法主要有：酶技術(shù)法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法和質(zhì)譜法，其中以酶顯色法、酶熒光法和HPLC法較為常用。但關(guān)于左旋肉堿分析方法的研究主要是實(shí)驗(yàn)性的、缺少總結(jié)和分析性的綜述文章，為了便于進(jìn)一步研究，現(xiàn)將上述方法綜述如下。

1酶技術(shù)法

酶技術(shù)法是目前測(cè)定左旋肉堿較為常用的方法，主要包括酶技術(shù)的分光光度法、放射酶法、自動(dòng)分析儀法、熒光光度法、酶循環(huán)法等。

1.1分光光度法

（1）酶顯色法。酶顯色法也被稱為2-硝基苯甲酸（DTNB）法，是目前測(cè)定左旋肉堿較為常用的方法。該方法最開始是由Marquis和Fritz于1964年建立，檢測(cè)了小鼠組織中的游離肉堿，后經(jīng)進(jìn)一步完善成為現(xiàn)在的方法。該方法的機(jī)理為：左旋肉堿與乙酰輔酶A（乙酰CoA）在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）的催化下反應(yīng)生成乙酰肉堿和游離輔酶A（CoASH）。CoASH和2-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，其顏色深淺與CoASH的含量成正比。因CoASH與左旋肉堿是等摩爾反應(yīng)關(guān)系，通過(guò)分光光度法測(cè)定CoASH生成量即可間接測(cè)定左旋肉堿的含量。

該方法操作經(jīng)濟(jì)、快捷，且該方法中催化反應(yīng)的CAT酶對(duì)于左旋肉堿和乙酰輔酶A之間的反應(yīng)具有專一性，從而可以排除右旋肉堿的干擾，故靈敏度較高，檢出限為0.6mg/100g，重復(fù)性和回收率較好，回收率在96.2%～104.7%之間。而且與化學(xué)法（通過(guò)比色法測(cè)定肉堿和溴酚藍(lán)反應(yīng)生成的有色物質(zhì)來(lái)測(cè)定肉堿）相比，此法不受樣品中所含季胺類物質(zhì)的影響。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 29989嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測(cè)定》中使用的便是此方法。

該方法也有不足，由于DTNB還能與待測(cè)樣品中其他的硫醇類（-SH）物質(zhì)起反應(yīng)，且DTNB與CoASH不能完全反應(yīng)，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。因此，為了消除SH物質(zhì)的干擾，Marquis在測(cè)定前將樣品置于90℃，pH8.5的環(huán)境中處理5min；也有人用H₂O₂氧化樣品中含硫醇基的物質(zhì)。

（2）2-酮戊二酸脫氫酶（OGDH）法。Jochen Schafer和Heinz Reichmann（1989）對(duì)原方法進(jìn)行改進(jìn)，在測(cè)定游離輔酶A時(shí)用2-酮戊二酸取代DTNB，在2-酮戊二酸脫氫酶（OGDH）催化下與CoASH反應(yīng)，生產(chǎn)琥珀酰輔酶A和還原型輔酶I（NADH），NADH在340nm處有強(qiáng)吸收。與原方法相比，OGDH與CoASH反應(yīng)的專一性更強(qiáng)，反應(yīng)更加完全，且不受其他SH的影響。該方法靈敏度高至nmol級(jí)，肉堿回收率在103%～115%之間，適合低肉堿含量的樣品。

1.2放射酶法

由于分光光度法敏感度較低，Cederblad和Lindstedt（1972）叫提出了用放射性同位素法來(lái)檢測(cè)少量血清樣品中皮摩爾級(jí)左旋肉堿的含量，其原理是將乙酰CoA用C14標(biāo)記，即[C14]乙酰CoA+肉堿一[C14]乙酰肉堿+CoASH，將乙酰肉堿從乙酰CoA中分離出來(lái)，并測(cè)定肉堿的含量。由于可逆反應(yīng)使反應(yīng)不完全，導(dǎo)致只有加入超過(guò)量的乙酰CoA才能得到線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。J.Denis Mc Garry和Daniel W.Foster（1976）對(duì)Cederblad和Lindstedt的方法進(jìn)行了改進(jìn)和簡(jiǎn)化，結(jié)果顯示，不需要過(guò)量的標(biāo)記乙酰CoA即可獲得比較寬的線性范圍；除此之外，即使在過(guò)量乙酰肉堿的存在下，也可以檢測(cè)非常少量的肉堿。

1.3自動(dòng)分析儀法

Lijun Wan和Richard W.Hubbard（1998）用全自動(dòng)生化分析儀代替普通分光光度計(jì)，對(duì)血清中游離和結(jié)合的左旋肉堿進(jìn)行測(cè)定。與原方法相比，使用全自動(dòng)生化分析儀在1小時(shí)內(nèi)即可完成檢驗(yàn)，大大縮短了分析時(shí)間，而且可以降低人工操作及實(shí)驗(yàn)材料引起的分析成本。此方法不僅適用大型醫(yī)院，也適用做臨床研究的小型實(shí)驗(yàn)室。Gitten Cederblad等（1986）也曾用生物離心式分析儀對(duì)生物組織中的左旋肉堿進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與原分光光度法相比，該方法具有試劑成本低、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，但與放射酶法相比，其靈敏度和精準(zhǔn)度不如放射酶法，且在血漿、透析液、尿液和肌肉組織中的檢測(cè)值比放射酶法偏高10%～25%。

1.4熒光光度法

Mitsuo Maehara等（1988）采用一種簡(jiǎn)單的熒光法對(duì)血清中游離肉堿進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定原理與分光光度法基本類似。肉堿與乙酰CoA在CAT的催化下反應(yīng)生成乙酰肉堿和CoASH，CoASH與BIPM耦合生產(chǎn)強(qiáng)熒光物質(zhì)CoA-BIPM，熒光強(qiáng)度與肉堿的含量成正比。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，可以得知血清中的肉堿含量。該方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別為5.2%和2.6%，肉堿回收率在98%～113%之間。與顯色法的測(cè)定結(jié)果相比具有良好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r>0.90）。該方法靈敏度較高，最低檢測(cè)限為10 μmol/L。

Kojiro Matsumoto等（1990）開發(fā)了熒光流動(dòng)注射法對(duì)丙戊酸治療的患者血清中的肉堿進(jìn)行測(cè)定。該方法使用了肉堿脫氫酶（CDH）和硫辛酰胺脫氫酶（DS）兩種固定化酶催化兩步反應(yīng)，第一步是肉堿和氧化型輔酶I（NAD+）在CDH的催化下反應(yīng)生成還原型輔酶I（NADH），第二步是NADH和刃天青（C12H7NO4）在DS的催化下反應(yīng)生成熒光物質(zhì)試鹵靈（C12H7NO3、），試鹵靈的熒光強(qiáng)度與肉堿的含量成正比。用該方法檢測(cè)肉堿時(shí)，肉堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.1～1.0nmol范圍內(nèi)呈線性，檢測(cè)的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為560nm和580nm。該方法適用于臨床試驗(yàn)中對(duì)肉堿缺乏癥的檢測(cè)。

由于熒光法的測(cè)定結(jié)果容易受到樣品中內(nèi)源性熒光物質(zhì)的影響，因此在測(cè)定過(guò)程中要對(duì)每一份樣品設(shè)置空白。

1.5酶循環(huán)法

Mamoru Takahashi等（1994）開發(fā)了一種使用肉堿脫氫酶（CDH）測(cè)定血清中左旋肉堿的高靈敏度方法。該方法是一個(gè)還原型輔酶I（NADH）、硫代氧化型輔酶I（Thio-NAD+）和肉堿脫氫酶（CDH）共同參與的新型酶循環(huán)技術(shù)，原理是左旋肉堿在CDH和Thio-NAD+的存在下轉(zhuǎn)化為脫氫肉堿，同時(shí)生成硫代還原型輔酶I（Thio-NADH），脫氫肉堿又在CDH和NADH的存在下轉(zhuǎn)化為左旋肉堿，同時(shí)生成NAD+，此反應(yīng)每循環(huán)一次，將生成與左旋肉堿等當(dāng)量的Thio-NADH，因此在一定時(shí)間內(nèi)，循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)便是Thio-NADH生成相當(dāng)于左旋肉堿的倍數(shù)，通過(guò)測(cè)定Thio-NADH積累而引起415nm處的光吸收增量，即可得知左旋肉堿的含量，還可以提高左旋肉堿的n倍靈敏度。

用該方法測(cè)定血清中L-肉堿時(shí)，L-肉堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～250μmol/L范圍內(nèi)呈線性，回收率在96.5%～106%之間，批內(nèi)與批間的變異系數(shù)（CV）分別為在0.66%～4.33%之間和1.02%～2.56%之間。該方法不受膽紅素、血紅蛋白、各種酯酰DL-肉堿和抗壞血酸鹽的干擾，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、精確、自動(dòng)。

2高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的先進(jìn)方法，主要有酶聯(lián)高效液相法、衍生高效液相法。

2.1酶聯(lián)高效液相法

酶分光光度法的準(zhǔn)確度較差，且由于乙酰CoA長(zhǎng)時(shí)間在pH7.8條件下容易發(fā)生水解，故不適合肝臟組織的檢測(cè)，Naoshi Takeyama等（1989）開發(fā)了酶聯(lián)高效液相色譜法解決了上述問(wèn)題。該方法采用高效液相色譜儀來(lái)檢測(cè)左旋肉堿與乙酰CoA生成的CoASH，而不使用DTNB，平均檢測(cè)1個(gè)樣品時(shí)間為60min，靈敏度可達(dá)nmol級(jí)。

2.2衍生高效液相法

衍生法最開始是由Minkler等（1984）研究的反相離子對(duì)高效液相法，將肉堿衍生為4-bromophenaeyl ester，于254nm檢測(cè)肉堿含量，肉堿檢測(cè)結(jié)果在10～100nmol/mL范圍內(nèi)呈線性。為了避免衍生時(shí)生產(chǎn)的副產(chǎn)物影響測(cè)定結(jié)果，在樣品預(yù)處理時(shí)應(yīng)盡量去除其中的氯離子和多余的衍生劑。該方法的靈敏度適用于測(cè)定尿液中的肉堿，但不適用測(cè)定血漿中的肉堿，且不能區(qū)分開兩個(gè)異構(gòu)體L-型和D-型。

Ke Li等（2010）用衍生高效液相-紫外檢測(cè)法對(duì)人血清中的游離肉堿和總?cè)鈮A進(jìn)行測(cè)定，將肉堿衍生為酯，于260nm檢測(cè)肉堿含量。該方法可同步測(cè)定血清中游離肉堿和總?cè)鈮A的含量。檢測(cè)肉堿的線性范圍為5～400μmol/L，批內(nèi)游離肉堿和總?cè)鈮A的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.36%和1.97%；批間游離肉堿和總?cè)鈮A的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.34%和1.77%。游離肉堿和總?cè)鈮A的平均回收率分別為98.2%和96.3%。

國(guó)內(nèi)趙亞明等（2006）建立了衍生高效液相色譜法檢測(cè)血漿中左旋肉堿的方法。研究發(fā)現(xiàn)左旋肉堿經(jīng)過(guò)衍生化處理后，在波長(zhǎng)260nm處有一強(qiáng)的吸收波，說(shuō)明衍生化反應(yīng)可以提高左旋肉堿的檢測(cè)靈敏度。該方法精密度RSD<4%、加樣回收率>70%，穩(wěn)定性良好，適用于臨床血漿左旋肉堿濃度的監(jiān)測(cè)。

李紅艷等、（2013）研究了衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定乳制品中左旋肉堿含量的分析方法。左旋肉堿經(jīng)提取后經(jīng)L-丙酰胺-β-萘胺衍生后，于激發(fā)波長(zhǎng)280nm、發(fā)射波長(zhǎng)328nm下測(cè)定。該方法得到的乳粉檢出限為4.0mg/kg、液體乳檢出限為0.5mg/kg，檢測(cè)的L-肉堿在0.2～20.0mg/L范圍內(nèi)呈線性，相關(guān)系數(shù)為0.9990，回收率在80%～90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于10%。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，適用于乳制品中L-肉堿的含量測(cè)定。

3離子色譜法（IC）

陳軍等（2013）提出了離子色譜法（IC）測(cè)定減肥食品中左旋肉堿含量的方法。以IonPac CSl7柱為離子交換柱，采用非抑制電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。該方法測(cè)定左旋肉堿的質(zhì)量濃度在10～1000mg，L范圍內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，檢出限為1mg/g，回收率在95.4%～101%，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～6.6%。

4質(zhì)譜法（MS）

三組研究人員分別研究了串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）測(cè)定血清中肉堿的方法。Hardy等（2001）開發(fā)的MS/MS法需要在質(zhì)譜分析前對(duì)肉堿進(jìn)行衍生，在衍生過(guò)程中乙酰肉堿會(huì)發(fā)生部分水解，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。Stevens等（2000）研究的MS/MS法不需要衍生反應(yīng)，但為了避免電噴霧電離過(guò)程中的載體干擾，樣品在質(zhì)譜分析前需要棉纖濾紙過(guò)濾和一定濃度的甲醇溶液洗脫。Chung Shun Ho等（2003）提出使用液相色譜（LC）來(lái)減少載體干擾，研發(fā)發(fā)現(xiàn)LCMS/MS法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生過(guò)程的水解問(wèn)題，且液相色譜可以消除載體干擾因素，適合于血清中游離肉堿和總?cè)鈮A的測(cè)定。竺琴等（2012）建立了嬰幼兒配方奶粉中高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法。在優(yōu)化條件下，樣品在10min內(nèi)完成分析，左旋肉堿在0.40～10.0mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回收率在87%～106%，檢出限和定量下限分別為39.0ng、116.9ng。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好、分析速度快，更適用于大量樣品的集中快速檢測(cè)。