堿性蛋白酶提取湘蓮蛋白質的工藝優化

江玉琴　柯偉倩　鄧放明

[摘要]湘蓮自古以來被作為一種營養保健食品，為高蛋白、低脂肪類食物，其蛋白質含量達約17%。為了更好地開發利用湘蓮蛋白質，通過測定蛋白提取率，考察堿性蛋白酶用量、提取溫度、提取時間以及液料比等要素對湘蓮蛋白質提取率的影響，并優化確定其最佳提取方法，即在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘蓮蛋白質的提取率可達92.61%，為工業生產中湘蓮蛋白質的提取提供了技術支撐。

[關鍵詞]湘蓮；蛋白質；堿性蛋白酶；提取率

中圖分類號：Q814.1 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180227

蓮是起源較早的被子植物之一，在經典植物學分類中蓮屬被置于毛莨目睡蓮科，世界上現存蓮屬有中國蓮和美洲黃蓮兩類。據現代研究分析，蓮子不僅富含糖類化合物和蛋白質，還含有豐富的鈣、鎂、磷，以及鐵、鋅、錳、銅等多種人體必需微量元素和VB、VC等人體必需的維生素，具有一定食療功效。

湘蓮起源于中國單瓣古蓮的原始栽培種，與福建建蓮、廣昌白蓮、武義昌蓮合稱為中國四大蓮子。湘蓮可被分為三大類別，分別為“寸三蓮”、雜交芙蓉蓮和“太空蓮”，其中，以富含蛋白質但脂肪含量較低的寸三蓮的質量最佳。且根據武漢商檢局將寸三蓮與建白蓮、贛白蓮以及湖蓮進行的營養成分對比分析結果可發現，寸三蓮在糖類化合物、蛋白質、脂肪以及鈣、磷等含量上高于其他蓮種，這也進一步佐證了寸三蓮的優越性。而且湘蓮蛋白質的營養價值也十分高，其含有較多的賴氨酸，可以彌補賴氨酸在谷類蛋白質中的缺乏，同時還包含很多糧作物中所缺失的組氨酸、精氨酸和酪氨酸，對兒童生長發育具有重大作用。然而，長期以來，我國對于湘蓮產品的深加工只是停留在通心蓮、糖水蓮子罐頭、蜜餞、蓮蓉等簡單工藝上，雖然劉忠義等以湘蓮作為輔料、配以固體乳和奶油，研制出了營養價值高的湘蓮冰淇淋，但關于湘蓮蛋白質的產品開發力度不夠。因此，進一步研究提取湘蓮蛋白質及其綜合應用具有重要意義。

目前國內外研究較多的提取蛋白質的方法有堿溶酸析、酶解提取、堿法提取、鹽溶酸沉、超聲提取、水酶法等，其中，酶法反應條件溫和、提取時間短且可以較大程度地保留蛋白質的營養價值。根據趙東海等在對比分析酸性、中性、堿性三種蛋白酶對米糠蛋白提取的效果中發現，堿性蛋白酶的提取效果最好，說明堿性蛋白酶具有較高的酶活力和酶穩定性。本試驗對堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質進行了單因素分析，并應用正交試驗優化確定提取湘蓮蛋白的最佳工藝方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

通心湘蓮：購于湖南宏興隆湘蓮食品有限公司；堿性蛋白酶：合肥博美生物科技有限責任公司（酶活力>200U/mg）；乙醇、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉均是分析純。

1.2儀器與設備

ZN-400A型高速中藥粉碎機，長沙市岳麓區中南制藥機械廠；K-S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精密試驗設備公司；DD5型大容量多管離心機，長沙英泰儀器有限公司；島津AUY220分析天平（0.000 1g）；KDN-103F自動凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；PH5-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1湘蓮蛋白質提取方法

將通心湘蓮干燥后進行粉碎、過100目篩，于4℃下保存。每次精準稱取5g蓮粉，放于250mL干燥的三角瓶，按一定的液料比加入蒸餾水后調節pH為8，加入堿性蛋白酶，搖勻，在一定溫度和時間下提取湘蓮蛋白質，提取完成后于80%下水浴15min，以達到滅酶效果，而后在5 000r/min的速度下將液料混合物離心15min。測定上清液體積和蛋白質含量，根據公式計算出湘蓮蛋白的提取率。

1.3.2單因素試驗

（1）固定酶用量為1.2%，提取溫度為55℃，提取時間為2h，加入不同的液料比（5：1、10：1、15：1、20：1、25：1），討論液料比對湘蓮蛋白質提取率的影響，并確定最佳液料比。

（2）固定酶用量為1.2%，液料比為15：1，提取時間為2h，設定不同的提取溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃），討論溫度對湘蓮蛋白質提取率的影響，并確定最佳提取溫度。

（3）固定酶用量為1.2%，液料比為15：1，提取溫度為55℃，設定不同的提取時間（1h、1.5h、2h、2.5h、3h），討論提取時間對湘蓮蛋白質提取率的影響，并確定最佳提取時間。

（4）固定液料比為15：1、提取溫度為55℃、提取時間為2h，加入不同的酶用量（0.5%、1%、1.2%、1.8%、2%），討論酶用量對湘蓮蛋白質提取率的影響，并確定最佳酶用量。

1.3.3正交試驗設計

結合單因素試驗，選取液料比、提取溫度、提取時間、酶用量四項要素進行4因素3水平的正交試驗，因素水平如表1。

1.3.4測定方法

湘蓮粗蛋白的測定：GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》第一法。

2結果與分析

2.1蓮子總蛋白含量

經試驗測得，湘蓮中總蛋白質含量為16.74%。

2.2單因素試驗結果與分析

2.2.1酶用量對湘蓮蛋白質提取率的影響

如圖1所示，湘蓮蛋白質的提取率在隨著堿性蛋白酶用量的增加而不斷提高。可能是由于酶的不斷增加，提高了不溶性蛋白的溶出。但當堿性蛋白酶的用量到達1.8%后，其增加幅度趨于平緩，這是因為各種酶在特定蛋白質分子上的作用位點數目是一定的，當酶用量到達一定水平后，酶與底物作用達到飽和，再提高酶用量并不能顯著加快酶促反應。因此綜合考慮蛋白質提取效果和酶成本后，選取1.8%為最佳酶用量。

2.2.2液料比對湘蓮蛋白質提取率的影響

如圖2所示，蛋白質的提取率受液料比的影響較為明顯。當加入的液料比小于20：1時，湘蓮蛋白質的提取程度伴隨液料比的增大而出現大幅度的增加趨勢。這可能是由于加入的液體增大了酶和底物的流動性，使得酶與底物相互作用接觸的機率更大。但當加入25：1的液料比時，堿性蛋白酶和底物都被稀釋，反應速率降低，因而湘蓮蛋白質的提取程度下降。對于工業生產而言，液料比的增大，不僅造成大量水消耗和增加廢水排出量，也會對后期的干燥濃縮程序產生負擔，因此，選取液料比20：1為最佳條件。

2.2.3提取時間對湘蓮蛋白質提取率的影響

如圖3所示，提取時間設定為1h時，被提取的湘蓮蛋白質較少，可能是因為蓮子粉本身需要一定時間溶脹。延遲提取時間至1.5h和2h后，蛋白質的提取率與提取1h的結果相比，都有較大的提升。這可能是因為提取時間的增長給予更多蛋白質溶出的機會，從而使蛋白提取率得到提高，2h時提取效果最好，提取率達至87%。若持續增長提取時間，酶的活力開始降低，底物也在減少，同時因為酶與底物作用飽和后，酶將會有更多的機會作用于已經溶出的蛋白質或者多肽，導致蛋白質被進一步被水解為氨基酸等小分子，提取率開始呈下降趨勢。因此，選取2h為最佳提取時間。

2.2.4提取溫度對湘蓮蛋白質提取率的影響

如圖4所示，湘蓮蛋白提取率隨著溫度的升高呈現先緩慢上升后下降的趨勢。當溫度在45-60℃范圍內逐漸升高時，湘蓮蛋白質的提取率在小幅度增加，因為適當加大溫度，可以增強堿性蛋白酶的活力，從而提高酶促反應速率。當溫度升至65℃時，蛋白質的提取程度明顯下降，結合曾紹校對蓮子淀粉糊化動力學的研究結果：蓮子淀粉在64.4下開始糊化，推測蛋白質提取率下降的原因可能是部分淀粉糊化影響了蛋白質的提取，還有可能是因為較高的溫度影響了堿性蛋白酶的活性，降低了其提取蛋白質的能力。由于在50-60℃的溫度范圍內，蛋白質的提取率相差不大，考慮到部分蛋白質可能因為溫度較高而發生變質，所以從節約能源和保持蛋白質功能特性等方面出發，選擇50%為最佳提取溫度。

2.3正交試驗結果與分析

以單因素試驗為基礎，進行堿性蛋白酶提取法正交優化試驗，選取液料比（V/W）、提取溫度（℃）、提取時間（h）、酶用量（%）為試驗因素作四因素三水平正交試驗，結果如表2所示。

由表2的極差分析結果可知，各要素對湘蓮蛋白質提取率的影響程度大小順序為A>C>D>B，即液料比>提取時間>酶含量>提取溫度，其優化提取工藝條件為A3C2D383，經驗證試驗，其湘蓮蛋白質的提取率為92.01%，低于正交試驗中的最優試驗組合A3C2D381。所以，堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質的優化提取工藝取A3C2D381，即在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，50%下提取2h，湘蓮蛋白質的提取率為92.61%。

3結論

在用堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質時，各因素對湘蓮蛋白提取程度的影響力大小依次是：液料比>提取時間>酶含量>提取溫度。即液料比的影響力最大，提取溫度的影響程度最小。并確定堿性蛋白酶法提取湘蓮蛋白質的最佳方法為，在液料比為20：1的條件下，加入1.8%的堿性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘蓮蛋白質的提取率可達92.61%。