16種液體處理劑對鐵皮石斛組培苗促生作用研究

秦建立 楊光宇

摘 要：選用玉蜀黍赤霉、枯草芽孢桿菌、石斛小菇3種細菌和真菌菌株以及與水楊酸、硝酸鑭、色氨酸、赤霉素結合配制16種液體處理劑，并以灌根方式處理，接種大棚鐵皮石斛組培苗。結果表明：4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸處理的鐵皮石斛組培苗株高顯著高于對照組（無菌水處理）；4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、1 mmol·L-1水楊酸、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸莖粗顯著高于對照組。說明接種4 g·L-1石斛小菇、5 mg·L-1赤霉素、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1硝酸鑭、4 g·L-1石斛小菇+5 mg·L-1赤霉素+1 mmol·L-1水楊酸液體處理劑處理能有效提高幼苗的株高、莖粗，液體處理劑有良好的促生效果。

關鍵詞：鐵皮石斛；菌根真菌；液體處理劑；促生

Abstract： Sixteen liquid treatment agents were formulated with the combination of three bacteria or fungal， Gibberella zeae， Bacillus subtilis and Mycena dendrobii， and salicylic acid， lanthanum nitrate， tryptophan and gibberellin， and treated tissue culture seedling of Dendrobium officinale in greenhouse by root irrigation. The results showed that the treatments of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 gibberellic acid+1 mmol·L-1 salicylic acid could significantly increase the plant height of Dendrobium officinale compared to the control （sterile water treatment）； The stem diameter of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 1 mmol·L-1 salicylic acid， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate treatments were significantly higher than that of the control group. It was indicated that the treatments of 4 g·L-1 Mycena dendrobii， 5 mg·L-1 gibberellin， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 lanthanum nitrate， 4 g·L-1 Mycena dendrobii+5 mg·L-1 gibberellic acid+1 mmol·L-1 salicylic acid could increase the plant height and stem diameter effectively， the liquid treatment agents of which had good growthstimulating effects on tissue culture plantlets of Dendrobium officinale in greenhouse.

Key words： Dendrobium officinale； mycorrhizal fungi； liquid treatment agent； growth stimulation

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是中國傳統名貴中藥材，具有很高的藥用價值和經濟價值[1]，被列為國家一級野生保護植物，屬于石斛屬植物，是蘭科植物中的第二大屬，主要產于溫涼高濕地帶，其所處的相對濕度、溫度、光照等環境因子對其影響很大，生長發育最好能與其他有益微生物混合生長[2]。目前對野生石斛的過度采挖和利用，導致其已無法滿足市場需求，因此，人工栽培市場前景較好[3]。

由于根際促生菌劑能夠促進植物的生長，防治作物病害，抵御生長環境中的有害病原菌，因此受到人們的廣泛重視[4]。近年來對根際促生菌劑的研究已成為熱點領域。根際微生物菌劑主要運用于如草莓、各種瓜類、果樹等移栽作物[5]。中國研制開發的彩色馬勃菌根固體劑型用于松樹育苗，可增加苗高、根徑、側根數，造林成活率增長幅度可高達169%[6]。目前菌劑的應用研究多為單一菌株以及少數的多種菌株，國內推廣應用的菌劑主要有促生菌劑、根瘤菌劑、固氮菌劑、解磷菌劑和解鉀菌劑等，關于復合液體處理劑對鐵皮石斛組培苗的促生作用研究報道較少。

目前鐵皮石斛人工種植均采用組培苗，存在著成本高、移栽成活率低、生長緩慢、產量低等問題[7]。在自然條件下，蘭科植物菌根真菌的共生對于鐵皮石斛種子萌發和植株生長是必不可少的[8]。自然條件下野生石斛的結實率很低，加上種子沒有胚乳直接提供營養，前期幼苗很難萌發，且其移栽成活率很低，石斛種子的萌發和植株的生長發育都需依賴菌根真菌與之共生，進而形成共生菌根有利于根部對礦質營養元素的吸收[9]。因此研究石斛菌根真菌與寄主植物的相互關系以及復合液體處理劑對鐵皮石斛組培苗的促生作用具有重要意義。

本課題組在前人的基礎工作之上研究以玉蜀黍赤霉、枯草芽孢桿菌和石斛小菇這3種菌株以及4種添加劑配制有益鐵皮石斛的液體處理劑，對鐵皮石斛組培苗促生作用方面進行研究，擬解決鐵皮石斛因缺少菌根真菌導致生長慢、資源不足的難題，對有效提高出瓶組培苗的成活率和生長質量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：本試驗的菌株石斛小菇（Mycena）來自鐵皮石斛的根部，于中國林業微生物菌種保藏中心管理購買；玉蜀黍赤霉（ Gibberella）于中國普通微生物菌種保藏管理中心購買；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）于中國農業微生物菌種保藏管理中心購買，購買后保存于實驗室。

供試植株：鐵皮石斛組培苗來自福建省廈門市集美區塔斯曼生物工程有限公司，試驗在該公司種植大棚內的苗床上進行，組培苗移栽至苗床后按照該公司大棚種植的常規方法進行管理（移栽后澆定根水，以基質澆透為準，養護時每天定時噴霧4～5次，濕度保持在80%左右，待新根長出后逐步減少噴霧次數）。種苗統一選擇株高（3.0±0.2）cm、有2～3條根的小苗進行小區試驗，在消過毒的松樹皮基質上移栽馴化好的鐵皮石斛幼苗。采用苗床栽培，苗床離地70 cm左右，共設4個區域，每個區域約150叢苗，種植密度為3 株1 叢，叢行距3 cm×3 cm。

菌劑的制備：先將實驗室保存的供試菌株在馬鈴薯葡糖糖瓊脂固體培養基（PDA）上活化2 d， 再將活性較好的菌株用PDA液體培養基擴大培養2 d，將菌絲團取出瀝干后稱重， 計算出每種菌株的總重量， 用無菌水配置成4 g·L-1的菌株；石斛小菇菌株在PDA固體培養基上活化2 d后用PDA液體培養基擴大培養至2周， 將菌絲團取出瀝干后稱重， 計算出每種菌株的總重量， 用無菌水配置成4 g·L-1的菌株；枯草芽孢桿菌在胰蛋白胨大豆瓊脂液體培養24 h后，有效活菌數的測定采用平板計數稀釋法，取10倍系列稀釋在胰蛋白胨大豆瓊脂固體培養基上培養計數，配制濃度為8.0×107 CFU·mL-1左右。

1.2 試驗方法

選取健壯、株高高度一致的鐵皮石斛組培苗用于接種，試驗按單因素和多因素隨機區組設計，設置多組處理組見表1，以灌根無菌水為對照（CK），每個處理10 株，重復3 次。

1.3 生長指標測定

統一條件管理，移栽70 d后從各組中隨機挑選10叢苗， 取叢中長勢最好的10株用流水沖洗干凈并晾干。分別測量不同處理幼苗的株高、莖粗等生長指標，每組重復3次測量求其平均值。

計算各處理組平均株高增量 （H）、平均莖粗增量 （S） ，根據幼苗生長指標來衡量液體處理劑的促生長效果。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016統計軟件進行不同處理間的記錄、統計、制表繪圖，采用SPSS22.0進行方差分析（LSD法）。

2 結果與分析

2.1 不同液體處理劑處理對鐵皮石斛株高增量的影響

由圖1可知，對照組平均株高增量為0.39 cm，除1、2、11、15號處理組以外，其余各處理平均株產量均高于對照組，其中3號（1.18 cm）、4號（1.24 cm）、12（1.25 cm）和13號（1.00 cm）處理的平均株高增量顯著高于對照組，分別為對照組的3、3.2、2.5和2.5倍。結果表明液體處理劑的施用能夠有效促進鐵皮石斛組培苗的株高生長。

2.2 不同液體處理劑處理對鐵皮石斛莖粗的影響

由圖2可知，對照組平均莖粗增量為0.51 mm， 除1、2、8、9、10、11、14、15號處理組以外，其余各處理平均莖粗增量均高于對照組，其中3號（1.11 mm）、4號（0.89 mm）、5號（1.36 mm）、12號（0.92 mm）、13號（1.04 mm）處理的平均莖粗增量顯著高于對照組，分別為對照組的2.2、1.7、2.7、1.8和2倍。結果表明液體處理劑的施用能夠有效促進鐵皮石斛組培苗的莖粗生長。

3 討論與結論

鐵皮石斛生長狀況與自身激素水平以及外界的營養供給有關[10]。本試驗所選赤霉素、水楊酸植物生長調節劑均不同程度的對鐵皮石斛組培苗株高和莖粗有促進作用，這一研究結果與前人研究結果一致[11]。植物促生菌劑已成為當前研究的熱點，具有促生作用的植物菌根真菌以及內生細菌由于有足夠的碳源、氮源等營養物質，且受到植物組織或根的保護，更易于發揮作用[12]。菌根真菌對宿主植物的促進作用主要體現在能更好地吸收營養物質、有利于次生代謝產物的積累等方面[13]，同時可以促進宿主植物對氮、磷等礦質元素的吸收，從而促進宿主植物的生長[14]。IAA是以色氨酸為前體物質，吲哚丙酮酸代謝途徑為其主要合成途徑[15]。但本試驗所用色氨酸的處理組并未能對鐵皮石斛產生促生作用，可能原因是色氨酸濃度問題，以及外界因素的影響導致。在以往接種添加劑多采用浸種、表面噴灑、涂抹的方式，由于本試驗添加劑的灌根處理方式導致其4種添加劑未能表現出良好的促生效果。吳靜萍等[16]在密花石斛菌根真菌中發現赤霉素，且能向外分泌，并認為適當濃度的赤霉素能促進石斛生根和莖的伸長，此研究結果與上述研究結果基本一致。添加劑物質可能在不同程度對菌根真菌侵染存在差異[17]，因此還需后續探究驗證。

石斛小菇菌根真菌能提高組培苗的株高和莖粗，在制成液體處理劑后避免了由真菌接種時含菌量過高而使共生關系失去平衡的問題，也不會因為培養基的殘留而污染組培苗。液體處理劑能夠促進鐵皮石斛組培苗的生長，其原因可能與真菌能產生某些植物激素刺激組培苗的生長，以及提高植物抗病抗逆機制或拮抗作用導致病原菌生長受到抑制有關。由于植物菌根真菌生境具有特殊性，本試驗中促生效果較好的液體處理劑能否適用于其他石斛植物，還有待進一步研究。

目前，微生物菌劑多為單一菌，混合菌劑的報道不多。單一純培養接種物缺少鐵皮石斛生長所需要的營養元素，育苗初期效果不佳，難以推廣。菌根真菌種類豐富多樣，其資源有待開發與利用，篩選新型高產高效的菌根真菌及復合菌劑是目前研究的熱點，今后將會有更廣闊的發展前景。本試驗研制含有菌根真菌與色氨酸、赤霉素、硝酸鑭、水楊酸的復合處理劑與傳統方式不同，菌劑的配方組合打破以往單一固體接種物的模式，避免了長期使用植物激素、單一菌劑、化肥、農藥所帶來的弊端，為我國菌根菌劑商品化生產提供新思路。

參考文獻：

[1]徐程，沈穎，張銘.石斛屬藥用植物鑒定研究[J].中草藥，2004，35（8）：11-12.

[2]吳征鎰.中國植物志（第19卷）[M].北京：科學出版社，1999.

[3]諸燕.鐵皮石斛11種金屬元素含量測定[C].全國藥用植物及植物藥學術研討會，2010.

[4]郭鳳仙，劉越，唐麗，等.藥用植物根際微生物研究現狀與展望[J].中國農業科技導報，2017，19（5）：12-21.

[5]王鵬.果樹菌根生物肥料的研究現狀[J].浙江柑橘，2013，30（4）：2-6.

[6]姚青.菌根真菌外生菌絲對難溶性無機磷酸鹽的活化及利用間接標記法[J].核農學報，2000，14（3）：145-150.

[7]徐文婷.石斛內生真菌固體菌劑對鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J].西南農業學報，2014，27（1）：317-324.

[8]陳寶玲，宋希強，胡美姣，等.美花石斛菌根真菌接菌方式與接種效應初步研究[J].植物研究，2011，31（1）：79-84.

[9]張延威.石斛莖部內生真菌的分離與分布[J].貴州農業科學，2007，35（2）：18-19.

[10]黃萬琳.不同培養基激素配比及營養因子對云南熱區鐵皮石斛苗的影響[J].曲靖師范學院學報，2013，32（3）：60-63.

[11]孔凡信，劉志，趙術偉，等.4種植物生長調節劑對高粱株高、莖粗的影響[J].農業災害研究，2015（5）：20-21.

[12]喻江.植物根組織內生細菌多樣性及其促生作用[J].中國農學通報，2015，31（13）：169-175.

[13]丁常宏.都曉偉，徐瑩，藥用植物內生真菌的功能研究進展[J].中醫藥學報， 2013，41（3）：168-171.

[14]石偉琦.丁效東，張士榮，叢枝菌根真菌對羊草生物量和氮磷吸收及土壤碳的影響[J].西北植物學報，2011，31（2）：357-362.

[15]趙曉菊.吲哚乙酸生物合成及其結合物水解的研究進展[J].中國農學通報， 2014，30（6）：254-259.

[16]吳靜萍，錢吉，鄭師章.蘭花菌根菌分泌物成分的初步分析[J].應用生態學報，2002，13（7）：845-848.

[17]楊中寶，王淼焱，劉潤進.外源養分和激素對AM真菌侵染和產孢的影響[J].菌物學報， 2005，24（2）：277-282.

（責任編輯：柯文輝）