抗菌肽對煙草青枯菌的抑菌作用

江仕龍 劉明宏 高亞星 蔣選利

摘?要：煙草青枯病是煙草生產上的主要病害之一，安全、有效的防治煙草青枯病對煙草生產具有重要的現實意義。為了解決煙草青枯病的防治這一難題，設計了5種人工合成的多肽和寡肽，采用抑菌圈測定法測定其對青枯菌的抑制效果。結果表明，編號為228的寡肽效果最好，有望成為新的青枯病生物防治藥劑。

關鍵詞：抗菌肽;青枯菌;抑菌作用;生物防治

中圖分類號：Q93

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0092-03?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.016

煙草青枯?。═obacco bacterial wilt）是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的危害世界煙草生產的重要病害。此病1880年首次發現于美國，現已成為熱帶和亞熱帶煙區最常見的病害之一，在我國長江以南各煙區發生普遍[1]。對煙草青枯病的防治，主要有選用抗病品種、優化栽培管理和藥劑防治這幾個措施，但是沒有十分理想的防治手段。近年來，尋找新的防治藥劑的目光落在了抗菌肽（antimicrobial peptide）上面[2]?？咕氖莿又参锵忍煨悦庖叩闹匾M成部分，是動植物防御微生物入侵的一道有效屏障[3]。它們能作用于革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、寄生蟲、癌細胞甚至是薄膜病毒，而絕大多數抗菌肽對哺乳動物的正常細胞是無害的，并且殺菌機制與傳統抗生素完全不同[4]。

本文在天蠶抗菌肽（Cecropin）的基礎上，通過修飾天蠶抗菌肽肽序，設計了5種多肽，采用抑菌圈測定法研究其對煙草青枯菌的抑菌作用。

1?材料與方法

1.1?材料

所用的五種多肽由上海淘普生物科技有限公司合成（見表1）。煙草青枯病菌（R.solanacearum）由作者自己分離、純化獲得。

1.2?方法

于固體NA培養基上活化保存的青枯菌24 h（28℃），然后用接種環刮取活化的青枯菌到裝有約125 mL液體NA培養基的錐形瓶，并將錐形瓶置于28℃、200 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h。24 h 取少許培養液，用紫外分光光度計測定其在490 nm處的吸光度，以蒸餾水作為對照，測得的OD值為1.70±0.05則可以直接用于下一步，如超過，則用無菌水稀釋培養液到該吸光度（此吸光度青枯菌濃度為106～107 cfu/mL，處于對數生長期）。然后用移液槍取100 uL培養液到有固體NA培養基的培養皿上，并用玻璃細菌涂布棒涂抹均勻待用。

稱取適量人工合成的凍干肽粉于2 mL規格無菌離心管中，并加無菌水稀釋配成母液，再以母液加無菌水稀釋到其他濃度，最后得到500 μg/mL、250 μg/mL和125 μg/mL三個濃度，分別用A、B、C表示。然后取適量滅菌濾紙片于裝有肽溶液和無菌水的離心管中浸泡，將浸泡后的濾紙片用鑷子夾出，放置于涂有細菌培養液的培養皿上，每個培養皿放同一處理的三個濾紙片，大致呈等邊三角形，每個處理用兩個培養皿，每個培養皿內做三個抑菌點測試，即相當于6個重復。最后將培養皿置于28℃恒溫培養箱中倒置培養;于48 h后測量抑菌圈大小，記錄并拍照。

2?結果與分析

本次實驗中使用的多肽，對煙草青枯病菌均有一定的抑制作用。其抑制作用的大小，與多肽的濃度有關，高濃度的時候抑菌圈最大，即抑菌活性最強，低濃度的時候抑菌圈小，即抑菌活性最弱。不同的多肽，其抑制作用不同，其中抑菌效果最好的是編號為228的多肽，最差的是編號為222的多肽。

天蠶抗菌肽是一類具有抗菌活性的肽的總稱，自從Steiner等1881年首次命名了兩種天蠶抗菌肽以來[5]，在常用的在線抗菌肽據庫APD（the Antimicrobial Peptides Database）和CAMPR3（Collection of Anti-Microbial Peptides）中，已經各自收錄了37條和185條天蠶抗菌肽序列（含人工合成序列），是抗菌肽研究中的熱門家族。但其對煙草青枯病菌是否具有抑菌作用，未見報道。在本試驗中，只有11個氨基酸殘基的寡肽比含有29個氨基酸殘基的多肽抑菌效果好，和以前報道的研究結果相似[6-7]。

3?結論與討論

在活性較強的4個寡肽中，雖然氨基酸殘基一樣，序列也高度相似，但是抑菌效果差別較大?？咕牡慕Y構-活性關系研究發現至少有7個因素和肽的生物活性有關，它們是大小、肽序、結構度、凈電荷、總疏水性、總親水性、螺旋的疏水面和親水面各自的寬度[8]。通過APD的結構預測工具，得知所有寡肽的凈電荷都是 +4，但只有編號為228的寡肽的疏水性基團所占比例為54%，其它3種寡肽的疏水性基團所占比例均為63%，這可能在一定程度上影響了寡肽的活性。

利用抗菌肽防治煙草青枯病屬于生物防治的一種，當前研究得比較多的生物防治方法是利用生防菌來防治煙草青枯病，即為傳統的生物防治方法。肖田等[9]的研究指出，生防菌防治效果的好壞，除了與生防菌菌株產生的抑菌物質有關，還與該菌株是否能夠在寄主上定殖、該菌株與致病菌位點競爭能力以及是否能夠誘導寄主抗性等因素有關。這些因素，加上青枯菌的多樣性和煙草不同的主栽品種，使得利用生防菌這種傳統的生物防治方法的防治效果不穩定，或者前期防治效果好后期防治效果差的情況時有發生[10]。相比之下，抗菌肽直接作用于細菌的細胞膜[11-12]，所以受其他因素的影響程度比生防菌小。因此，將篩選到抑菌效果理想的抗菌肽，利用微生物發酵技術繁殖這種抗菌肽，用于生產中防治植物病害，是一種全新的生物防治技術，該方法屬于現代生物防治方法。這種利用抗菌肽的現代生物防治方法在人類疫病防治方面應用較多，而在植物病害防治方面非常少。本研究以煙草青枯病為對象，進行了初步的抑制作用研究，僅僅是利用抗菌肽防治植物病害研究的開始，隨后將進一步進行田間防效試驗研究，為控制煙草青枯病提供新的生防技術。

參?考?文?獻：

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[3]?司菡.抗菌肽的研究進展[J].熱帶醫學雜志，2008，8（4）：393-396.

[4]?徐靈龍，王云峰，石星明，等.抗菌肽及其功能研究[J].中國生物工程雜志，2007，27（1）：115-118.

[5]?Stciner H，Hultmark D，Engstrom A，et al.Sequence and specicity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature，1981（292）：246-8.

[6]?Andreu D，Ubach J，Boman A， et al.Shortened cecropin A-melittin hybrids Significant size reduction retains potent antibiotic activity[J].FEBS letters，1992，296（2）：190-194.

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