黑曲霉發酵液中5-HMF含量的測定

陳家祥 徐策 張素 熊德欣 代園鳳 鄭澤軒 陳雪 李祝

摘?要：本實驗建立了測定黑曲霉（Aspergillus niger）發酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。對5-HMF標準溶液進行全波長掃描，確定最大吸收波長為測定波長，并繪制5-HMF濃度與吸光度之間的標準曲線;用50%乙醇將原發酵液稀釋50倍，在測定波長處測定吸光度，對應標準曲線，計算發酵液中的5-HMF含量。結果表明，5-HMF最大吸收波長為283 nm，R2為0.9995，線性關系良好，發酵液5-HMF平均濃度為171.743 μg/mL，平均回收率105.86%，精密度RSD為0.13%，重復性RSD為0.40%，儀器檢出限為0.007 μg/mL。該方法簡便，快速，成本低，準確度較高，為今后研究黑曲霉中5-HMF含量提供了一個可借鑒的方法。

關鍵詞：黑曲霉;5-HMF;紫外分光光度法

中圖分類號：Q939.96

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0087-05?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.015

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），又名5-羥甲基-2-糠醛[1]，由葡萄糖或果糖脫水生成[2]，其分子中含有一個呋喃環，醛基和羥基，性質非常活潑，可通過氧化、氫化和縮合等反應制備多種衍生物，是一種良好的化學平臺物質。5-羥甲基糠醛可用于生產燃料和反應中間體[3]，同時還有抗癌細胞增值活性，降血糖等藥理作用[4-5]，近年我國5-羥甲基糠醛產品行業銷售收入呈指數增長[6]，應用前景廣泛。

黑曲霉為曲霉屬的一個常見種[7]，可生產檸檬酸[8]，糖化酶[9]等，也可作為宿主進行外源表達，廣泛用于食品原料、藥物、酶的生產[10-11]，是發酵工業中的重要菌種。于能江[12]從頭孢酶屬的發酵物中分離出5-HMF，陳楠等人[13]從蜜環菌中提取5-HMF，均表明微生物發酵液中可產5-HMF。黑曲霉在工業生產中應用廣泛，利用黑曲霉發酵生產5-HMF可彌補化學法步驟復雜繁瑣的缺點。在對黑曲霉中5-HMF高產培養體系的建立中對發酵液內的5-HMF含量測定是必不可少的步驟。

目前測定5-HMF的方法主要有HPLC法[14-16]、紫外分光光度法[17-19]、衍生化分光光度法[20]等。HPLC法樣本處理及測定過程繁瑣復雜且成本較高，不適用于長期而頻繁的測定;衍生化分光光度法需將5-HMF生成衍生化合物后間接測量，步驟較繁瑣，紫外分光光度法簡單快捷，在5-HMF的測定中應用較多。如馮紅偉等人[21]利用紫外分光光度法測定糖蜜中的5-HMF，劉月新[22]利用紫外分光光度法測定四物湯傳統湯劑中的5-HMF。本實驗將利用紫外分光光度法對黑曲霉發酵液中5-HMF含量進行測定。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

1.1.1?菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中國典型培養物保藏中心保存，CCTCC No：M206021。

1.1.2?試劑

5-HMF（≥99.0%）：廣東翁江化學試劑有限公司;無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司;葡萄糖（分析純）：天津市優譜化學試劑有限公司。

1.1.3?儀器與設備

BIOMATE 3S紫外分光光度計：賽默飛世爾科技有限公司;UV-8000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司;華普達THZ-82恒溫振蕩器：常州華普達有限公司。

1.2?實驗方法

1.2.1?5-HMF標準品全波長掃描與標準曲線繪制

精確吸取2.5 μL 5-HMF標準品，利用50%乙醇配制成31.075 μg/mL的儲備液。精確吸取10 mL母液，加入40 mL 50%乙醇，配制濃度為6.215 μg/mL的標準液。

將標準液于UV-8000紫外可見分光光度計進行全波長掃描，取最大吸收峰值對應波長作為測定波長。

將標準液用50%乙醇梯度稀釋，得0、1.243 μg/mL、2.486 μg/mL、3.729 μg/mL、4.972 μg/mL、6.215 μg/mL的6份稀釋液。6份樣品以50%乙醇為參比，在測定波長進行吸光度測定，并繪制標準曲線。

1.2.2?黑曲霉發酵液中5-HMF濃度的測定

將黑曲霉接種至PDB培養基，于26℃，150 r/min振蕩頻率下培養5 d，過濾掉發酵液中的菌絲球及孢子，于發酵液中加入等體積的無水乙醇，10000 r/min離心10 min沉淀絮狀變性蛋白，吸取上清液，繼續加入50%乙醇，得到原發酵液50倍稀釋度的稀釋液。

分別取稀釋液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL加入5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL的50%乙醇，得到5個梯度稀釋樣品，以50%乙醇為參比，于283 nm下測定吸光度，根據標準曲線計算發酵液中的5-HMF平均濃度。

1.2.3?精密度測定

取同一份稀釋液8份，以同樣方法直接測定吸光度，計算相對標準偏差。

1.2.4?回收率測定

配置與發酵液5-HMF濃度相近的5-HMF標準溶液，與發酵液在相同稀釋度下等體積混合后測定，計算回收率。

1.2.5?重復性實驗

對同一批發酵液以相同方法平行處理，分析重復性。

1.2.6?儀器檢出限測定

配制濃度為0.213 μg/mL、0.426 μg/mL、0.533 μg/mL、0.639 μg/mL的5-HMF標準溶液，利用BIOMATE 3S紫外分光光度計測定吸光度，繪制低濃度下的標準曲線，并測定20組參比的吸光度，計算儀器檢出限。

2?結果與分析

2.1?全波長掃描

標準液于190～1100 nm進行全波長掃描，發現283 nm處有最大吸收峰（200～400 nm部分掃描結果），故采用283 nm作測定波長。

2.2?5-HMF標準品濃度與吸光度回歸曲線

5-HMF標準品溶解于50%乙醇中，其通過計算得到的濃度與所對應的吸光度結果見表1，線性回歸曲線，R2為0.9995，線性關系良好，回歸方程為y = 0.1225x + 0.005。

2.3?發酵液5-HMF濃度測定

對稀釋液梯度稀釋后的6份樣品測定，利用標準曲線求出濃度（見表2），再分別根據總稀釋度求出原發酵液5-HMF濃度，為165.714 μg/mL、173.333 μg/mL、172.143 μg/mL、173.714 μg/mL、173.810 μg/mL，平均值為171.743 μg/mL。

2.4?精密度測定

取稀釋液8份，直接進行紫外分光測定（見表3），RSD為0.13%，重現性良好。

2.5?回收率測定

配制186.450 μg/mL的5-HMF標準溶液，與原發酵液各稀釋50倍后等體積混合并測定（結果見表4），平均回收率為105.86%，RSD為1.03%，回收率較好，可以較準確反映發酵液中5-HMF實際含量。

2.6?重復性實驗

取同一批發酵液8份，以同樣方法測定其中5-HMF含量（見表5），RSD為0.40%，重復性良好。

2.7?儀器檢出限

配制0.746 μg/mL的低濃度5-HMF標準溶液，進行梯度稀釋，繪制標準曲線，計算其斜率，低濃度時靈敏度0.1397。以20組50%乙醇進行空白測定，得空白均值為0.009，空白值標準偏差為0.03%，根據IUPAC標準[23]，k取3用于檢出限計算，得最小分析信號為0.010，BIOMATE 3S紫外分光光度計測定黑曲霉發酵液中5-HMF濃度檢出限為0.007 μg/mL。

3?結論與討論

本實驗建立了測定黑曲霉發酵液中5-HMF含量的紫外分光光度法。5-HMF標準品全波長掃描得283 nm處有最大吸收峰，故以283 nm作為測定波長;標準曲線為y=0.1225x+0.005，線性關系良好，用此法測定黑曲霉xj發酵液中的5-HMF平均濃度為171.743 μg/mL，與HPLC測定結果0.1257 mg/g相近[24]，平均回收率為105.86%，能較準確地反應5-HMF實際含量，方法重現性良好。儀器檢出限為0.007 μg/mL，可以精準測定。此法操作簡便快速，成本低，準確度較高，但由于比色法會受到一定的干擾，測定結果不能視為5-HMF絕對含量，可為研究黑曲霉中5-HMF含量提供一個可借鑒的方法。

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