紅曲固態發酵產色素工藝條件的優化

童愛均 黃梓芮 洪家麗 呂旭聰 劉斌

摘 要：以果糖添加量、氯化銨和初始含水量為自變量，以紅曲霉總色價為響應值，采用響應面優化法對紅曲產色素的固態發酵條件進行了優化，結果表明：最優培養基條件為果糖添加量0.54%、氯化銨添加量0.06%和初始含水量46.00%，該設計中模型預測的色素最大值為6693.99 U·g-1。進行重復驗證試驗，經測定實際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預測的色素最大值相差不大，說明模型設計合理，吻合度較高。

關鍵詞：紅曲色素；固態發酵；培養基優化；響應面試驗

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.05.008

Abstract： The solid fermentation conditions of red yeast for pigment production were optimized by using the response surface optimization method in which fructose additive amount， ammonium chloride amount and initial water contents as independent variables and total pigment value as response ones. The results showed that the optimal medium conditions were with 0.54% fructose， 0.06% ammonium chloride， and 46.00% initial water content. The predicted maximum pigment content in this design was 6693.99 U·g-1. Repeated verification tests were conducted， and the actual pigment production reached 6684.16 U·g-1， which was with little difference with the predicted maximum pigment output in the model， indicating that the model was well-designed with a high degree of coincidence.

Key words： Monascus pigment； solid fermentation； medium optimization； response surface test

紅曲，是紅曲菌（Monascus）的發酵產品，在我國的福建、浙江、江西、廣東、臺灣一帶廣為使用[1]。紅曲色素是紅曲的次級代謝產物，是天然色素中穩定性最佳的色素[2-4]，作為一種藥食兩用的天然色素其應用前景非常廣闊。近年來，由于亞硝酸鹽的安全性問題紅曲色素逐漸替代亞硝酸鹽作為內制品著色劑[5-6]。

在固態發酵中，紅曲色素受固體基質、外加碳源、外加氮源、無機鹽、初始含水量等多種因素的影響，總色價普遍偏低，制約了紅曲色素大規模規范化工業生產[7-9]。提高紅曲色素產量包括菌種誘變、固定化細胞技術、菌種聯合培養、超聲波處理與優化培養基等多種途徑[10]。如何優化固體發酵培養基、提升發酵水平、提高色素產量等技術問題，已經倍受國內外相關科研機構關注與研究[11-12]。本研究采用響應面分析法對實驗室篩選培育的紅曲色素高產菌株進行固體發酵的培養基優化，旨在提高紅曲色素產量，為大規模規范化工業生產做好理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 紅曲霉M3：由本試驗室篩選保存。

1.1.2 主要儀器 UV2601型紫外可見分光光度計：北分瑞利公司有限公司；ME204E分析天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；LRH生化培養箱：上海一恒科學儀器公司；OKS24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；VD850型潔凈工作臺：蘇州凈化設備公司等。

1.1.3 主要試劑 孢子洗脫液：含0.9% NaCl溶液；70%乙醇：70 mL乙醇用超純水定容到100 mL；拌料液：用乳酸調得pH=5的超純水；果糖、氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等均為國產試劑分析純。

1.1.4 培養基

1.1.4.1 斜面培養基 PDA培養基：稱取300 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4層紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂各20 g，繼續加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1000 mL，分裝試管，加塞、包扎，（121℃）滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存備用。

1.1.4.2 固體發酵培養基 紅米20 g、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.30%與果糖（0.4%、0.6%、0.8%）、氯化銨（0.03%、0.07%、0.11%）分別裝入250 mL三角瓶中，乳酸調得pH=5的超純水（40%、50%、60%），浸泡12 h后包扎，121℃滅菌30 min，稍冷卻后搖散，接種。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法 試管斜面培養：試管斜面接種后在30℃培養箱中培養7 d，至菌絲長滿斜面。茄子瓶斜面培養：茄子瓶斜面接種后在30℃培養箱中培養7 d，至菌絲長滿斜面。紅曲色素固體發酵培養：接種5 mL于裝有基質的250 mL三角瓶中，于30℃條件下避光培養10 d。

1.2.2 發酵物色價的測定 取發酵物約0.5 g，用70%乙醇10 mL浸泡振蕩，超聲波10 min過濾，取濾液適當稀釋后在410、465、510 nm下測吸光度值分別為黃、橙、紅色價。總色價=（OD410+OD465+OD510）×稀釋倍數[13]。

1.2.3 培養基優化的響應面試驗 根據Box-Benhnken 的原理，建立中心組合試驗設計數學模型，采用Desin-Expert.8.05b版本中的Central Composite Design設計法以果糖添加量（A）、氯化銨添加量（B）和初始含水量（C）3個因子為自變量，紅曲總色價產值（Y）為響應值，進行3因子3水平的試驗設計。Central Composite Design試驗設計因素與水平列于表1。用Desin-Expert.8.05b軟件對響應面試驗結果進行處理和方差分析，根據所得數據進行多元回歸分析，得到響應變量（果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量）與響應值（色價）之間的多元二次回歸方程。

2 結果與分析

2.1 模型方程的建立

響應變量（果糖添加量、 氯化銨添加量和初始含水量）與響應值（色價）之間的多元二次回歸方程。

2.2 回歸系數及顯著性檢驗

根據表2的數據，對M3紅曲霉總色價的回歸模型進行方差分析，結果列于表3。該回歸模型極顯著（P<0.0001）。回歸模型的相關系數R2=0.9943，校正系數R2Adj=0.9891，變異系數為7.43%，表明模型的擬合程度較好，試驗誤差小。失擬項P值為0.599 6，提示其影響不顯著，即失擬項與純誤差之間差異不顯著。該模型擬合較好，線性關系顯著，可以用于后續的理論推測，可以對紅曲固態發酵條件進行分析及預測。對回歸方程系數進行顯著性檢驗，果糖添加量A及其二次項A2，氯化銨添加量B及其二次項B2，初始含水量C及其二次項C2對總色價有著極顯著（P<0.01）的影響；設計中果糖與其他2個因素之間交互作用不顯著（P>0.05）3個因素對紅曲固態發酵產色素能力的影響強度順序依次為初始含水量>氯化銨添加量>果糖添加量。

2.3 雙因子效應分析

雙因子效應分析見圖1a、圖1b，圖2a、圖2b，圖3a、圖2b。對二次回歸方程求解，可得出3個因素果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量的最佳水平，此時可得3個因素的真實值，A=0.54、B=0.06、C=46.00。即最優培養基條件：果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量為0.06%和初始含水量46.00%，該設計中模型預測的色素最大值為6693.99 U·g-1。

為驗證該模型，采用模型中的最佳發酵條件：果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量0.06%、初始含水量46.00%、0.30% KH2PO4、0.20% MgSO4、初始pH 5.0、培養溫度30℃

、裝米量20 g、接種量5 mL。按照以上條件進行了5次重復紅曲菌發酵培養試驗，經測定實際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預測的色素最大值相差不大，說明模型設計合理，吻合度較高。

3 結論

利用模型的響應面對二次回歸方程求解，可得出果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量的最佳水平，即最優培養基條件：果糖添加量3個因素0.54%、氯化銨添加量0.06%和初始含水量46.00%，該設計中模型預測的色素最大值為6693.99 U·g-1。果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量0.06%、初始含水量3個因素46.00%、KH2PO40.30% 、MgSO40.20% 、初始pH 5.0、培養溫度30℃、裝米量20 g、接種量5 mL。按照以上條件進行了5次重復紅曲菌發酵培養試驗，經測定實際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預測的色素最大值相差不大，說明模型設計合理，吻合度較高。

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（責任編輯：柯文輝）