丹綠補(bǔ)腎膠囊HPLC特征圖譜

王文鵬 周永妍 郝鵬彬 張巖巖 劉建偉 孫勝斌 姜國(guó)志 李軍山

摘 要：為了提高丹綠補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜法，對(duì)其特征圖譜進(jìn)行了方法學(xué)考察。選用phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊特征圖譜。結(jié)果表明：在優(yōu)化的色譜條件下，丹綠補(bǔ)腎膠囊中的各成分得到了較好分離，以胡椒堿為參照峰，確定了7個(gè)共有峰，計(jì)算得出了各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。10批共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.0%。所建立的特征圖譜能較好地評(píng)價(jià)丹綠補(bǔ)腎膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量，為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中藥藥劑學(xué);丹綠補(bǔ)腎膠囊;特征圖譜;胡椒堿;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R917 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

HPLC specific chromatograms of Danlv Bushen capsules

WANG Wenpeng，ZHOU Yongyan，HAO Pengbin，ZHANG Yanyan，

LIU Jianwei，SUN Shengbin，JIANG Guozhi，LI Junshan

（Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China）

Abstract：In order to improve the quality control standard of Danlv Bushen capsule， the HPLC characteristic chromatogram of Danlv Bushen capsul is investigated by HPLC. Chromatographic conditions： The phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-0.2% aqueous phosphoric acid are used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL/min and the detection wavelength at 220 nm. The column oven temperature is kept at 30 ℃，the characteristic map of Danlu Bushen capsule ias established. In the chromatographic conditions， the constituents of Danlv Bushen capsules show a good separation， seven common peaks are identified， and the relative retention time of the characteristic peaks and the S peaks is calculated. The RSD values of the 10 groups of common peak relative retention time are all less than 1%， and the relative peak area RSD values are less than 2%.The established characteristic atlas could evaluate the quality of Danlv Bushen capsule， and lay a foundation for improving the quality standard.

Keywords：pharmacy of traditional Chinese medicine; Danlv Bushen capsules; specific chromatograms; piperine; HPLC

丹綠補(bǔ)腎膠囊是由白花丹、射干、綠包藤、胡椒、干姜等經(jīng)提取精制而制得的一種膠囊劑[1]，用于治療男性形衰體弱、性欲低下甚或陽(yáng)痿、遺精、不育等癥狀，還用于治療女性未老先衰、容顏無(wú)華、顏面黑斑、月經(jīng)不調(diào)、宮寒不孕等癥狀[1-4]。

現(xiàn)行的丹綠補(bǔ)腎膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，鑒別項(xiàng)中只對(duì)白花丹、綠包藤和胡椒堿進(jìn)行控制，含量項(xiàng)中只對(duì)胡椒藥材成分中的胡椒堿進(jìn)行測(cè)定，難以有效控制丹綠補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量[5]。近年來(lái)，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究中，指紋圖譜和特征圖譜分析技術(shù)因能體現(xiàn)中藥整體特征而受到了廣泛關(guān)注和認(rèn)可[6-15]。為了合理地提高丹綠補(bǔ)腎膠囊制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，筆者對(duì)其HPLC特征圖譜進(jìn)行了方法學(xué)考察，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材 料

1.1 主要試劑與儀器

乙腈，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;磷酸，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

Agilent 1260型高效液相色譜儀;SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司提供;KH3200E型超聲清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供;CPA225D電子天平，德國(guó)賽多利斯公司提供。

1.2 樣品與對(duì)照品

丹綠補(bǔ)腎膠囊10批，批號(hào)分別為15070551，15070651，15070751，15101161，15101261，15101361，16051651，16051751，16051851，16051951，云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司提供。

射干苷對(duì)照品，批號(hào)為111632-200602;胡椒堿對(duì)照品，批號(hào)為110775-201405;次野鳶尾黃素對(duì)照品，批號(hào)為111557-200602。對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：phenomenex Luna C18（2） （4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，10%A→15%A;25～65 min，25%A→70%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 參照物溶液

取綠包藤對(duì)照藥材、射干苷對(duì)照藥材各1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲處理60 min，取出，放冷，搖勻，過(guò)濾。取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取射干苷對(duì)照品、次野鳶尾黃素對(duì)照品和胡椒堿對(duì)照品適量，用甲醇分別制成每1 mL含 20.0，40.0，80.0 μg的混合溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.2.2 供試品溶液

精密稱定丹綠補(bǔ)腎膠囊內(nèi)容物0.35 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量;超聲處理30 min，放冷后再稱定質(zhì)量。用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)為16051951），按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以胡椒堿為S峰。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于04%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.9%。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)為16051951），按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件在0，1，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.5%，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)為16051951）6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.2%，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.6%。

2.3.4 色譜峰歸屬

按處方制備綠包藤、射干苷陰性樣品，分別按“222”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，1號(hào)、3號(hào)峰歸屬為綠包藤藥材;2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)峰為射干藥材;7號(hào)峰為胡椒藥材。

2.4 特征圖譜

2.4.1 特征圖譜的建立

精密吸取參照物溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到參照物HPLC圖譜（見(jiàn)圖1）。精密稱定10批丹綠補(bǔ)腎膠囊樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析，建立特征圖譜（見(jiàn)圖2）。

圖1 混合對(duì)照品圖譜

2 4 2 特征圖譜共有色譜峰的標(biāo)定

取10批丹綠補(bǔ)腎膠囊的供試品溶液，分別按“21”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，采集色譜圖，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察。結(jié)果表明，10批共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于10%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于20%。將10批溶液的色譜圖按照《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2008版）對(duì)保留時(shí)間0～65 min的色譜峰進(jìn)行分析，選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性好及特征明顯的色譜峰為共有峰，共標(biāo)記7個(gè)共有峰。選定這7個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)模板，并以此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊HPLC特征圖譜。同時(shí)經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，確定了3個(gè)色譜峰，即射干苷（2號(hào)峰）、次野鳶尾黃素（5號(hào)峰）、胡椒堿（7號(hào)峰），建立丹綠補(bǔ)腎膠囊特征圖譜共有模式。

2 4 3 樣品測(cè)定

取10批丹綠補(bǔ)腎膠囊樣品，分別按“222”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“21”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖及各共有峰的峰面積，結(jié)果良好，詳見(jiàn)圖3。

3 結(jié)果與討論

1）丹綠補(bǔ)腎膠囊中所含的成分較多，為了保證樣品的充分提取，通過(guò)采用不同濃度的甲醇進(jìn)行超聲、回流選擇性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)加甲醇適量、超聲30 min的提取效果最佳。通過(guò)用甲醇-0.2%磷酸、乙腈-02%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)不同柱溫（25，30，35 ℃）、不同流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）進(jìn)行篩選，最終優(yōu)化得到了本文的色譜條件。在此優(yōu)化條件下，各色譜峰分離效果較好，可用于丹綠補(bǔ)腎膠囊特征圖譜的分析。

2）采用HPLC梯度洗脫法對(duì)丹綠補(bǔ)腎膠囊進(jìn)行研究，建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊特征圖譜，制劑中藥材的主要色譜峰在220 nm處均能體現(xiàn)，且在此波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)的色譜峰數(shù)量較多，響應(yīng)值較好，故選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)處，3種藥材均有特征峰呈現(xiàn)，根據(jù)峰歸屬結(jié)果，綠包藤的特征峰為1號(hào)和3號(hào)峰，射干苷的特征峰為2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)峰，胡椒堿的特征峰為7號(hào)峰。

3）建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊的液相特征圖譜，系統(tǒng)地反映了丹綠補(bǔ)腎膠囊化學(xué)成分的全貌。該圖譜方法的建立可作為丹綠補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量控制方法，通過(guò)對(duì)丹綠補(bǔ)腎膠囊進(jìn)行分析，找出了7個(gè)共有峰。選取胡椒堿的峰作為參照峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在（規(guī)定值±5）之內(nèi)。規(guī)定值為 0.188（峰1），0.460（峰2），0.634（峰3），0802（峰4），0.908（峰5），0.938（峰6），1.000（峰7）。

4）本研究采用高效液相色譜法對(duì)丹綠補(bǔ)腎膠囊的多種指標(biāo)性成分進(jìn)行測(cè)定，建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊的特征圖譜，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法全面反映產(chǎn)品質(zhì)量狀況的不足，使該產(chǎn)品的質(zhì)量控制技術(shù)更加完善、科學(xué)，為今后的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了一種可利用的質(zhì)量控制模式。目前的研究只定位了射干苷、次野鳶尾黃素和胡椒堿3個(gè)色譜峰，后期將進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)其他峰成分的全面考察。

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