轉CmCSA基因雙鏈RNA水稻的RNAi效應鑒定

趙鳳 杜娟 李尚偉 張澤杰

摘?要：稻縱卷葉螟是危害水稻的主要害蟲之一，幾丁質合成酶是昆蟲幾丁質合成通路上最后一個酶，對昆蟲的生長發(fā)育至關重要。本研究對轉稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因雙鏈RNA（dsCmCSA）水稻進行了室內和田間RNA干擾（RNAi）效應鑒定。結果表明，相比于對照組，取食轉dsCmCSA水稻的稻縱卷葉螟體型變小，蛻皮困難，出現畸形表型，死亡率明顯增加。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析表明，取食轉基因水稻株系CAⅡ-5的幼蟲體內CmCSA表達量比對照組下降了54.00%。田間實驗結果表明，轉基因水稻株系CAⅡ-5的卷葉率和白葉率分別為7.98%和5.04%，與對照組差異顯著。轉dsCmCSA水稻具有明顯的RNAi效應，抗蟲效果較好。該研究為利用轉基因RNAi技術對稻縱卷葉螟進行綠色防控奠定基礎。

關鍵詞：稻縱卷葉螟;幾丁質合成酶A;RNA干擾;抗蟲性

中圖分類號：Q966

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0036-05?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.007

水稻是一種主要的谷類糧食作物，全球有一半以上的人口以大米為食。我國是主要的稻米生產國和消費國之一，因此，水稻的豐產和我國經濟的發(fā)展具有緊密的聯系。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis），俗稱卷葉蟲、苞葉蟲等，屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是危害水稻的四大害蟲之一，嚴重影響水稻的產量[1-2]。稻縱卷葉螟是一種典型的遷飛性害蟲，目前對該蟲的防治方法主要是噴灑農藥，但由于長期使用化學藥物，不僅帶來嚴重的“3R”問題，還使得糧食的安全問題日益突顯。因此，尋找一種綠色、環(huán)保、經濟的害蟲防治方法迫在眉睫。

幾丁質（chitin）是存在于自然界中的一類天然多聚物，是昆蟲外骨骼、氣管、中腸等組織的重要組分，對昆蟲的生長發(fā)育和繁殖等生理過程具有重要作用[3]。昆蟲幾丁質的合成是一個由多種酶參與調控的復雜過程，其中幾丁質合成酶（chitin synthase）是幾丁質合成通路中最后一個酶，能催化UDP-N-乙酰氨基葡糖形成幾丁質多聚物，在幾丁質合成過程中至關重要，是控制害蟲的理想靶標。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是機體抵抗病毒或其它外來核酸入侵的重要保護性機制，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）抑制細胞內與其同源基因的表達，導致轉錄后基因沉默現象（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[4]。由于RNAi作用具有高度的特異性、高效性和放大效應，已經被廣泛應用于如抗人體病毒研究、腫瘤治療、植株品種改良等生物領域[5]。在昆蟲學中，RNAi技術主要用于基因功能研究以及害蟲的防治，研究者將體外合成靶標基因的dsRNA或小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）通過飼喂、注射、轉基因等方式導入昆蟲體內引發(fā)RNAi效應，獲得目標基因的生理缺陷，從而一方面可鑒定昆蟲基因功能，另一方面也達到防治害蟲的目的。Chen等[6]通過RNAi沉默甜菜夜蛾Spodoptera exigua 幾丁質合成酶A基因（SeCSA），昆蟲的生長發(fā)育受到抑制，出現蛻皮障礙、表皮幾丁質層不能正常形成、氣管發(fā)育畸形等現象。Mao等[7]利用轉基因技術將細胞色素P450基因導入棉花中，棉鈴蟲 Helicoverpa armigera在取食表達靶標基因dsRNA的轉基因棉花后出現發(fā)育遲緩癥狀。應用 RNAi 技術能有效地保護農作物抵抗害蟲危害，在農作物遺傳改良進行精準抗蟲方面具有重大的應用前景。

本實驗室利用植物轉基因技術，獲得表達稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A（CmCSA）基因dsRNA （dsCmCSA）的轉基因水稻。本研究用轉基因水稻子一代植株葉片分別在室內和田間飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲，鑒定轉基因水稻株系的RNAi效應，旨在為利用轉基因RNAi防治稻縱卷葉螟奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?供試昆蟲與水稻

供試昆蟲稻縱卷葉螟由本實驗室飼養(yǎng)[8]。在人工氣候箱內用稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度70%～80%，光周期14L∶10D。供試水稻為本實驗室種植的轉dsCmCSA 的中花11。

1.2?引物設計

利用Primer 6.0根據轉基因水稻靶標片段設計特異性PCR引物，同時針對CmCSA的開放閱讀框序列設計實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物（表 1），檢測取食轉基因水稻植株的稻縱卷葉螟CmCSA基因mRNA表達水平。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin（GenBank登錄號：JN029806）為內參對照。

1.3?轉dsCmCSA水稻的PCR檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分株提取8個轉dsCmCSA水稻子一代株系（CAⅠ-3.1、CAⅠ-3.2、CAⅡ-2、CAⅡ-3.1、CAⅡ-3.2、CAⅡ-4.1、CAⅡ-4.2和CAⅡ-5）的DNA，以其為模板，利用表1中的引物，進行PCR擴增，檢測水稻植株中是否存在轉入的目標序列。反應條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共36個循環(huán)，72℃ 延伸10 min，10℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4?室內抗蟲性檢測

用葉片測定法進行RNAi水稻的室內抗蟲性鑒定。分別剪取8個轉dsCmCSA水稻株系的5片葉，用浸有保鮮液的棉花包裹好后放入不同的玻璃直管（12 cm×3 cm）中，每管接15頭稻縱卷葉螟3齡幼蟲，將玻璃直管兩端用紗布封口，然后將玻璃直管置于條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度70%～80%，光周期14L∶10D的人工培養(yǎng)箱，每天定時在直管兩端噴灑保鮮液，3 d更換一次葉片。用正常水稻作為對照，每組設3個重復。每隔24 h，觀察記錄幼蟲取食、表型及存活情況。

1.5?死亡率與校正死亡率

稻縱卷葉螟取食轉dsCmCSA水稻后，檢測CmCSA敲低對稻縱卷葉螟生長的影響。在接蟲7 d后統計死亡率和校正死亡率，死亡率計算公式：死亡率=死亡蟲數/總蟲數×100%;校正死亡率計算公式：校正死亡率=（實驗組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率） ×100%。

1.6?CmCSA基因沉默效應檢測

為了更精確地檢測RNAi效應，使用RT-qPCR技術檢測取食轉dsCmCSA水稻植株的稻縱卷葉螟體內CmCSA的mRNA表達水平，以CmActin為內參對照。在稻縱卷葉螟3齡幼蟲取食轉dsCmCSA水稻植株葉片7 d 后，分別收集實驗組和對照組玻璃直管中各2頭存活的幼蟲，用HP Total RNA Kit（Omega Bio-tek，USA）分別提取總RNA，具體步驟按照說明書進行操作。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分別檢測總RNA的完整性和純度。按照PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa，China）試劑盒說明書，取1 μL總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。反轉錄體系為20 μL：1 μL RNA，1 μL Olige （dT）18 Primer，4 μL 5×Reaction Buffer，1 μL RNase Inhibitor（20 U/μL），2 μL dNTP Mixture，1 μL Revert Aid M-MuLV RTase （200 U/μL），10 μL RNase free Water。反應條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min。然后以cDNA為模板在C1000 qPCR儀上進行RT-qPCR檢測。PCR反應體系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad，USA），補加滅菌水到總體積20 μL。反應條件為：95℃預變性1 min，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。采用CFX Manager軟件（Bio-Rad，USA）進行實驗數據記錄與分析。

1.7?田間抗蟲性檢測

將轉dsCmCSA水稻以小區(qū)塊種植于惠水縣試驗田，選25株罩上尼龍網，至分蘗盛期（7月下旬），在每個網中的水稻上人工接種50頭稻縱卷葉螟低齡幼蟲，30 d后統計水稻的卷葉率和白葉率。平均每株卷葉率=卷葉數/網中水稻葉片總數/25;平均每株白葉率=白葉數/網中水稻葉片總數/25。每個處理重復3次，以正常水稻作為對照。

1.8?數據與分析

采用2-ΔΔCt 法分析稻縱卷葉螟取食轉dsCmCSA水稻葉片后，其體內CmCSA基因的mRNA相對表達量。結果以平均值±標準差表示，根據數據繪制柱形圖。采用SPSS 22.0統計軟件中的方差分析（ANOVA）的最小顯著性差異（LSD）法進行多重比較檢驗（P <0.05）。

2?結果與分析

2.1?轉dsCmCSA水稻的外源DNA片段檢測

以不同轉dsCmCSA水稻植株的DNA為模板，進行PCR檢測，電泳結果顯示轉dsCmCSA水稻子一代植株存在靶標DNA片段，可以用于后續(xù)的抗蟲性鑒定實驗。

2.2?CmCSA基因mRNA表達水平

在稻縱卷葉螟幼蟲取食轉dsCmCSA水稻7 d 后，分別提取實驗組和對照組稻縱卷葉螟總RNA，進行RT-qPCR檢測。結果顯示，在取食8個不同轉dsCmCSA水稻植株后，稻縱卷葉螟幾丁質合成酶A基因的表達水平明顯下降，與對照組相比，差異顯著。因此，取食轉dsCmCSA水稻后，稻縱卷葉螟體內CmCSA基因具有明顯的沉默效應。

2.3?取食和表型變化

接蟲后每隔24 h觀察稻縱卷葉螟幼蟲的取食情況，檢測轉dsCmCSA水稻子一代株系對試蟲的RNAi效應。結果顯示，在取食表達CmCSA dsRNA水稻葉片24 h后，稻縱卷葉螟幼蟲的取食情況和對照組沒有明顯差異;但48 h后，實驗組幼蟲出現明顯的拒食現象，而對照組水稻葉片被大量取食。在接蟲7 d后，實驗組幼蟲明顯小于對照組，蛻皮困難，出現畸形和死亡現象;部分存活幼蟲也不能正常化蛹，即使能夠化蛹，但是蛹明顯小于對照組或出現畸形。這些結果表明，取食轉dsCmCSA水稻葉片后，稻縱卷葉螟幼蟲活力降低，生長發(fā)育受阻。

1，4：取食正常水稻葉片的幼蟲; 2：取食轉基因水稻葉片的幼蟲變小; 3：取食轉基因水稻葉片的幼蟲出現畸形;5，7，9：取食正常水稻葉片的幼蟲能正常化蛹;6，8：取食轉基因水稻葉片的幼蟲不能化蛹;10：取食轉基因水稻葉片的幼蟲化成的蛹變小

2.3?死亡率與校正死亡率

接蟲7 d 后，統計實驗組和對照組幼蟲存活情況，結果表明，在分別取食8個轉基因水稻植株7 d后，相較于對照組（701），稻縱卷葉螟死亡率大幅增加，實驗組與對照組差異顯著（表2）。這些結果表明，RNAi效應明顯，轉基因水稻子一代株系對稻縱卷葉螟產生明顯的致死效應。

2.5?田間抗蟲性檢測

在田間人工接蟲30 d后，轉基因水稻株系的卷葉率和白葉率明顯少于對照組（表3），二者之間差異顯著。結果表明，轉dsCmCSA水稻能引發(fā)RNAi效應，稻縱卷葉螟選擇性拒食這些轉基因水稻。

3?結論與討論

幾丁質是昆蟲體壁、中腸、氣管等多個組織的重要組成成分，對昆蟲的生長發(fā)育、蛻皮、繁殖具有重要作用。幾丁質的合成是一個有多種酶參與調控的復雜過程，幾丁質合成酶是幾丁質合成通路上的最后一個酶，對昆蟲幾丁質的合成至關重要。幾丁質合成酶是無脊椎動物體內特有的酶，故常被作為潛在綠色殺蟲劑的理想靶標。本研究中，通過給稻縱卷葉螟飼喂表達CmCSA基因dsRNA的轉基因水稻葉片，可以觀察到試蟲生長發(fā)育受阻，蛻皮困難，并出現畸形，最終導致死亡;部分能完成蛻皮，體型比對照組幼蟲小，無法繼續(xù)生長至化蛹;或者能夠化蛹，但是蛹的大小明顯小于對照組或發(fā)育為畸形蛹。RT-qPCR檢測結果表明，CmCSA基因被有效沉默，mRNA表達水平顯著低于對照組。我們推測出現上述結果的原因可能是由于CmCSA表達下降，幾丁質合成通路紊亂，幾丁質含量降低，影響新表皮的形成，導致試蟲蛻皮困難，發(fā)育阻滯。Chen等[6]發(fā)現SeCSA表達被抑制之后，甜菜夜蛾生長發(fā)育受到阻礙，蟲體無法正常完成蛻皮，即使完成蛻皮，蟲體小于正常幼蟲，無法繼續(xù)生長至蛹。Arakane 等[9]干擾赤擬谷盜Tribolium castaneum幾丁質合成酶基因（TcCHS1），發(fā)現TcCHS1能影響幼蟲-幼蟲，幼蟲-蛹和蛹-成蟲的蛻皮，且對于昆蟲的繁殖和卵的孵化都有影響。Zhang 等[10]研究發(fā)現，飛蝗Locusta migratoria 2 齡若蟲LmCHS1 （LmCHSA）被抑制后，飛蝗蛻皮時新舊表皮難以分離，無法正常完成蛻皮，最終死亡。以上研究結果表明，CSA在昆蟲的生長發(fā)育過程中至關重要，該基因表達下降直接影響昆蟲的正常生長發(fā)育。

自2001年Johansen首次通過構建了具有綠色熒光蛋白基因（GFP）回文序列的重組質粒，并將其轉入煙草中成功表達dsRNA，成功沉默轉GFP基因煙草中的熒光信號以來，培育表達dsRNA的轉基因作物技術已逐漸成熟，并已經被用于研究多種植食性昆蟲的防治[12]。2007年，Baum等[13]通過飼喂表達V-ATP基因dsRNA的轉基因玉米，發(fā)現玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera發(fā)育遲緩，死亡率升高，顯著減少其對玉米的為害，對玉米有顯著的保護作用;同年Mao等[7]將棉鈴蟲H.armigera中與解毒代謝直接相關的CYP6AE14 dsRNA在擬南芥和煙草上成功表達，使得取食轉基因植物的棉鈴蟲CYP6AE14基因表達受到抑制，從而使棉鈴蟲對棉子酚的抗性顯著降低，導致其出現發(fā)育遲緩癥狀。這兩項研究結果表明，通過RNAi介導的轉基因植物用于害蟲控制有巨大的潛能。在此之后，RNAi介導的轉基因植物已經成功被用于多種害蟲的防治。如Han等[14]飼喂棉鈴蟲H.armigera表達dsHaHR3的棉花，導致棉鈴蟲畸形并大幅死亡，棉花產量大幅增加;Zha等[15]通過在水稻中表達褐飛虱Nilaparvata lugens中腸里高表達的3個基因NlHT1、Nlcar和Nltry，取食轉基因水稻的褐飛虱，這3個基因均有效地被沉默;Mao等[16]研究發(fā)現，取食表達hunchback基因dsRNA的轉基因煙草后，煙蚜Myzus persicae繁殖受阻，hunchback基因的表達顯著被抑制。上述研究表明，選擇合適的靶標基因，通過植物介導的RNAi沉默昆蟲體內的特定基因表達，能夠控制蟲害的發(fā)生，這將有效減少化學農藥的使用，降低環(huán)境污染，為作物害蟲防治開辟了新的領域。

參?考?文?獻：

[1]?申效誠，張桂芬，薛俊杰，等.稻縱卷葉螟的預報系統模型[J].中國農業(yè)科學，1988，21（3）：58-64.

[2]?鐘承茂.稻縱卷葉螟的為害癥狀與發(fā)生規(guī)律[J].農技服務，2008，25（1）：40-60.

[3]?ZHUO W，FANG Y.，KONG L，et al.Chitin synthase A：a novel epidermal development regulation gene in the larvae of Bombyx mori[J].Molecular Biology Reports，2014，41（7）：4177-4186.

[4]?FIRE A，XU S，MONTGOMERY MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[5]?林?晨.茶尺蠖幾丁質合成酶基因克隆及其雙鏈干涉重組病毒毒力研究[D].杭州：浙江大學，2010.

[6]?CHEN XF，TIAN HG，ZOU LZ，et al.Disruption of Spodoptera exigua larval development by silencing chitin synthase gene A with RNA interference[J].Bulletin of Entomological Research，2008，98（6）：613-619.

[7]?MAO YB，CAI WJ，WANG JW，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1307-1313.

[8]?田?宇，杜?娟，李尚偉，等.稻縱卷葉螟海藻糖酶基因的克隆、分子特性和表達分析[J].昆蟲學報，2016，59（6）：602-612.

[9]?ARAKANE Y，MUTHUKRISHNAN S，KRAMER KJ，et al.The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix[J].Insect Molecular Biology，2010，14（5）：453-463.

[10]?ZHANG JZ，LIU XJ，ZHANG JQ，et al.Silencing of two alternative splicing-derived mRNA variants of chitin synthase 1 gene by RNAi is lethal to the oriental migratory locust，Locusta migratoria （Meyen）[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2010，40（11）：824-833.

[11]?李大琪，王?燕，張建琴，等.中華稻蝗幾丁質酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能[J].中國農業(yè)科學，2014，47（7）：1313-1320.

[12]?JOHANSEN LK; CARRINGTON JC.Silencing on the spot.Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system[J].Plant physiology，2001，126（3）：930-938.

[13]?BAUM JA，BOGAERT T，CLINTON W，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1322-1326.

[14]?HAN Q，WANG Z，HE Y，et al.Transgenic Cotton Plants Expressing the HaHR3 Gene Conferred Enhanced Resistance to Helicoverpa armigera and Improved Cotton Yield[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（9）：1874-1886.

[15]?ZHA W，PENG X，CHEN R， et al.Knockdown of Midgut Genes by dsRNA-Transgenic Plant-Mediated RNA Interference in the Hemipteran Insect Nilaparvata lugens[J].Plos One，2011，6（5）：e20504.

[16]?MAO J，ZENG F.Plant-mediated RNAi of a gap gene-enhanced tobacco tolerance against the Myzus persicae[J].Transgenic Research，2014，23（1）：145-152.