一測多評法同時測定車前子配方顆粒中3種成分含量

田方 李軍山 常云鳳 高晗 李雪利

摘 要：為實現對車前子配方顆粒多指標成分的質量評價，解決中藥化學對照品分離難度大、單體性質不穩定、供應價格高等問題，建立了一測多評法同時測定車前子配方顆粒中的3種有效成分含量。以京尼平苷酸為內標物，建立與蘆丁、毛蕊花糖苷的相對校正因子，測定其含量，同時采用外標法測定這3種成分的含量，比較兩種方法的結果差異。結果表明：京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷分別在0.804～8.040，0.172～1.720，0.158～1.580 μg范圍內線性關系良好（r≥0.999），平均加樣回收率分別為102.52%，102.00%和101.86%，RSD值分別為1.64%，1.06%和1.07%。一測多評法所得結果與外標法差異不明顯，具有較高的重復性、穩定性及可信度，可為車前子配方顆粒的質量評價提供參考依據。

關鍵詞：中藥化學;車前子配方顆粒;京尼平苷酸;蘆丁;毛蕊花糖苷;一測多評

中圖分類號：R2841 ??文獻標志碼：A

Simultaneous determination of three constituents in Plantago

Seed formula granules by QAMS

TIAN Fang1， LI Junshan1，2， CHANG Yunfeng1， GAO Han1， LI Xueli1

（1. Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2. TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei ?050200， China）

Abstract：In order to achieve the quality evaluation of the multi-index components of Plantago Seed Formula Granules and to solve the problem of the difficulty in separating the chemical reference substances of traditional Chinese medicine and the unstable supply price of monomer properties， the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is established to simultaneously determine the content of three effective components in Plantago Seed formula granules.Geniposidic acid is used as the internal reference substance， and the relative correction factor of Rutin and Verbascoside is established respectively， measuring the content， and the three constituents are determined by the relative correction factor. At the same time， the content of the 3 components is determined by external standard method， and the difference between the results of the two methods is compared. Geniposidic acid， Rutin and Verbascoside show good linear relationships within the ranges of 0.804～8.040，0172～1.720，0.158～1.580 μg（r≥0.999），whose average recovery rate is 102.52%，102.00%，101.86%，and the RSD is 164%，1.06%，1.07% correspondingly. The results obtained by QAMS are close to the external standard method. The results turn out that it is no obviously difference between the two Methods and the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is accurate and feasible， which could provide a reference for the quality evaluation of Plantago Seed formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese materia medica;Plantago Seed formula granules; Geniposidic acid; Rutin; Verbascoside; quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）

車前子為車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥成熟種子，性寒，味甘，歸肝、腎、肺、小腸經，《神農本草經》將其列為上品，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效，用于治療熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽[1]，主產于江西、河南等地。本研究所用樣品為車前的干燥成熟種子經水提取、濃縮、噴霧干燥而制成的顆粒，具有免煎易服、攜帶方便、計量準確、調配方便等優點，受到廣大醫患人員的歡迎[2]，但關于該制劑的質量控制方法目前尚無統一標準，相關報道也較少。

車前子配方顆粒的臨床療效是其活性成分、藥理活性的綜合體現，僅以單指標成分評價其質量高低有一定的局限性，難以體現制劑的整體質量。2015年版《中華人民共和國藥典》收錄了一測多評法測定黃連、丹參等藥材成分的含量，很好地解決了中藥化學對照品分離難度大、單體性質不穩定、供應價格高等問題，實現了中藥多指標的質量評價[3-4]。也有研究人員報道了采用HPLC-DAD，對配方顆粒多種成分實現了中藥多指標質量評價[5]。筆者采用一測多評法，測定車前子配方顆粒中京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷的含量，建立了用一種中藥化學對照品同時評價3種成分含量的方法，探討了該方法的可行性與適用性。

1 主要儀器與材料

高效液相色譜儀，日本島津公司提供;AE 240電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo有限公司提供;KH-3200E超聲波清洗器，江蘇昆山禾創超聲儀器有限公司提供。

京尼平苷酸對照品（批號為11828-201604，質量分數為97.4%），蘆丁對照品（批號為11630-201607，質量分數為98.2%），毛蕊花糖苷對照品（批號為111530-201512，質量分數為96.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院;車前子配方顆粒，共12批，分別購自神威藥業、三九企業集團、江陰天江藥業、四川新綠色藥業、湖北康仁堂藥業、廣東一方制藥有限公司;乙腈，色譜純;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果[STBZ][6-10]

2.1 色譜條件

Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.5%（體積分數，下同）冰醋酸，檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min。流動相梯度洗脫條件見表1，色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備

取車前子配方顆粒，研細，精密稱取0.50 g，置入具塞錐形瓶中，精密加入60%（體積分數，下同）甲醇25 mL，稱定質量，超聲（250 W，40 kHz）60 min。取出，室溫放置，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷對照品適量，加入一定量的60%的甲醇，制成0.402，0.086，0.079 mg/mL的對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

精密吸取對照品溶液2，6，10，12，16，20 μL，注入液相色譜儀，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，結果見表2。由表2可知，各成分在各自范圍內的線性關系均良好。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，連續進樣6次，測得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁精密度RSD值分別為0.23%，0.19%和0.28%，表明儀器的精密度良好。儀器精密度測定結果見表3。

2.4.3 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，于0，2，4，6，10，12，16，18和24 h分別進樣，測得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁峰面積RSD值分別為0.42%，0.34%和0.32%，表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。穩定性考察結果詳見表4。

2.4.4 重復性試驗

取同一樣品，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，測得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁

峰面積與取樣量比值的RSD值分別為0.38%，0.32%和0.27%，表明方法的重復性良好。重復性考察結果見表5。

2.4.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一樣品各0.10 g，共6份，分別按樣品含量的80%，100%，120%加入

對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，計算其回收率，結果見表6。

2.5 相對校正因子測定[STBZ][11-15]

2.5.1 計算方法

取混合對照品溶液進樣2，6，10，16，20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak）計算相對校正因子。其中：Ak為內標物峰面積;Wk為內標物濃度;Am為組分m的峰面積;Wm為組分m的濃度。以京尼平苷酸為內標，計算蘆丁、毛蕊花糖苷相對校正因子，結果見表7。

2.5.2 耐用性考察

在3種不同廠家高效液相色譜儀和3種不同型號的色譜柱上進行測定，計算平均值，結果見表8;測定在不同柱溫、流速下的相對校正因子，結果見表9和表10。

2.5.3 色譜峰定位

利用相對保留時間對待測組分進行定位，考察不同品牌色譜柱的相對保留時間。結果表明，各組分在6種不同品牌色譜柱中的出峰順序相同，蘆丁、毛蕊花糖苷的相對保留時間分別為1.68和1.72，RSD值分別為1.22%和1.41%，表明相對保留時間可以用于色譜峰的定位。

2.5.4 樣品含量測定

按“2.2”項下方法制備12批車前子配方顆粒供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件分別采用外標法和一測多評法進行測定，結果如表11所示。由表11可知，2種方法所得結果差異不明顯（RSD值<3.0%），表明一測多評法與外標法測定結果無明顯差異。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇

采用DAD檢測器對供試品溶液進行全波長掃描，紫外光譜圖見圖2。研究發現，京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷的最大吸收波長分別為238，255，328 nm。綜合考慮色譜圖的基線、分離度、數目及峰面積，最終選擇檢測波長為260 nm。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

對供試品的提取溶劑（25%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇、水）和超聲時間（10，30，60 min）進行比較，發現采用60%甲醇超聲60 min時，各成分的提取效率較高，色譜圖的峰型較好。

3.3 內標物的選擇

京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷在車前子配方顆粒中的含量較高，由于京尼平苷酸化學性質穩定，且2015版《中華人民共和國藥典》將其作為車前子藥材質量優劣的評價指標，故選擇京尼平苷酸作為內標物。

4 結 論

1）目前中藥化學標準品的數量和種類仍不能滿足質量檢測的需要，實際應用中常采用分別檢測有效成分的方法來控制中藥及其制劑的質量，檢測效率較低，檢測成本偏高。一測多評法利用中藥中各成分間的相對校正因子同時測定多個有效成分，實現了在對照品缺乏的情況下進行中藥多成分的質量控制，顯著降低了檢測成本，提高了工作效率，對于中藥及其制劑的研究與開發具有重要意義。

2）以車前子配方顆粒為研究對象，通過方法學考察、相對校正因子確認、耐用性考察、色譜峰定位等過程，對一測多評方法的可行性與適用性進行了探討，所得結果與外標法差異不明顯，具有較高的重復性、穩定性及可信度，可為車前子配方顆粒的質量評價提供參考依據。

3）筆者僅對6個生產廠家12批次的配方顆粒進行了研究，對于更多批次和其他廠家的數據有待進一步加以研究;此外，對于不同產地的車前子制成的配方顆粒的相對校正因子、相對保留時間也未進行考察。針對以上不足，一測多評法測定車前子配方顆粒中多種成分含量的相關研究需要進一步對藥材的產地和批次進行考察，以明確方法的普遍適用性。

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