GSTP1rs1695基因多態(tài)性與自體造血干細(xì)胞移植患者血液學(xué)毒性的關(guān)系研究

張關(guān)敏 劉衛(wèi)平 馬旭 朱軍 王小沛 張艷華

中圖分類號(hào) Q786；R446.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）07-0980-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.28

摘 要 目的：研究GSTP1（rs1695）（簡(jiǎn)稱GSTP1）基因多態(tài)性與自體造血干細(xì)胞移植患者使用CBV方案（環(huán)磷酰胺、卡莫司汀、依托泊苷）預(yù)處理后血液學(xué)毒性之間的關(guān)系。方法：對(duì)2015年4月-2017年6月到我院治療的83例使用CBV方案預(yù)處理的自體造血干細(xì)胞移植患者進(jìn)行回顧性分析，采用熒光染色原位雜交檢測(cè)法測(cè)定GSTP1 A313G的多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)血液學(xué)毒性和粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱發(fā)生率以及白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板植入時(shí)間，分析GSTP1基因與上述指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果：83例患者中28例（33.73%）存在有至少1個(gè)基因位點(diǎn)的變異，A等位基因頻率為81.3%，G等位基因頻率為18.7%。GSTP1 AA基因型患者發(fā)生Ⅳ度白細(xì)胞、Ⅳ度中性粒細(xì)胞、Ⅳ度血小板減少的時(shí)間分別為化療后（8.91±1.25）、（9.02±1.19）、（11.56±1.58） d，攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者減少的時(shí)間分別為化療后（8.61±1.17）、（8.68±1.19）、（11.44±1.34） d。GSTP1 AA基因型患者白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板的植入時(shí)間分別為自體造血干細(xì)胞回輸后（11.98±1.99）、（10.44±1.35）、（15.55±2.18） d；攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者植入時(shí)間分別為自體造血干細(xì)胞回輸后（12.41±2.44）、（10.36±1.62）、（16.29±3.15） d。GSTP1 AA基因型及攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者移植期間發(fā)生Ⅲ～Ⅳ度貧血的患者分別為24、11例，分別占對(duì)應(yīng)基因型患者的43.64%、39.29%；發(fā)生粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱的分別為21、11例，分別占對(duì)應(yīng)基因型患者的38.18%、39.29%，但上述差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：GSTP1基因多態(tài)性與自體造血干細(xì)胞移植患者使用CBV方案預(yù)處理后的血液學(xué)毒性未見相關(guān)性，亦不影響干細(xì)胞植入時(shí)間。

關(guān)鍵詞 GSTP1（rs1695）；基因多態(tài)性；CBV方案；自體造血干細(xì)胞移植；血液學(xué)毒性

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the relationship of GSTP1 （rs1695） （simply as GSTP1） gene polymorphism with the hematological toxicity in autologous hematopoietic stem cell transplantation （AHSCT） patients who used CBV regimen （cyclophosphamide， carmustine， etoposide）. METHODS： A total of 83 AHSCT patients receiving CBV regimen were retrospective analyzed in our hospital during Apr. 2015-Jun. 2017. The gene polymorphism of GSTP1 A313G was detected by fluorescence staining in situ hybridization. The hematological toxicity and the incidence of agranulocytosis fever， the implantation time of leukocyte， neutrophils and platelet were analyzed statistically. The relationship of GSTP1 with above indexes were analyzed. RESULTS： Among 83 patients， gene variation was observed in one gene loci at least of 28 patients （33.73%）. The gene frequency of A allele was 81.3%， while that of G allele was 18.7%. The reduce time of Ⅳ grade leukopenia， Ⅳ grade neutropenia and Ⅳ grade thrombocytopenia in GSTP1 AA genotype patients were （8.91±1.25），（9.02±1.19）， （11.56±1.58） d after chemotherapy； those of patients with GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were （8.61±1.17）， （8.68±1.19）， （11.44±1.34） d after chemotherapy. The implantation time of leukocyte， neutrophils and platelet in patients with GSTP1 AA genotype were （11.98±1.99），（10.44±1.35），（15.55±2.18） d after autologus peripheral blood stem cell reinfusion； those of patients with GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were （12.41±2.44），（10.36±1.62），（16.29±3.15） d after autologus peripheral blood stem cell reinfusion. The case number of grade Ⅲ-Ⅳ anemia were 24 and 11， accounting for 43.64% and 39.29% of corresponding genotype patients. The case number of agranulocytosis fever in patients with GSTP1 AA genotype or GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were 21 and 11 during transplantation， accounting for 38.18% and 39.29% of corresponding genotype patients， respectively， without statistical significantly （P>0.05）. CONCLUSIONS： There is no relationship between GSTP1 gene polymorphism and hematological toxicity of AHSCT patients receiving CBV regimen.

KEYWORDS GSTP1； Gene polymorphism； CBV regimen； Autologous hematopoietic stem cell transplantation； Hematological toxicity

大劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植是晚期淋巴瘤的鞏固治療手段，也是復(fù)發(fā)難治淋巴瘤的挽救治療方法，能夠延長(zhǎng)患者的生存期、提高患者的生活質(zhì)量[1]。含有環(huán)磷酰胺的預(yù)處理方案，如BuCy方案（白消安、環(huán)磷酰胺）及CBV方案（環(huán)磷酰胺、卡莫司汀、依托泊苷）等是造血干細(xì)胞移植前常用的預(yù)處理化療方案[2-3]，常見的不良反應(yīng)有骨髓抑制、消化道反應(yīng)、感染等。

環(huán)磷酰胺是一種無活性的前藥，在體內(nèi)首先經(jīng)細(xì)胞色素P450酶（CYP）系代謝活化，生成4-羥基環(huán)磷酰胺（4-OHCPA）而發(fā)揮細(xì)胞毒作用，4-OHCPA可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磷酰胺氮芥和丙烯醛，4-OHCPA及磷酰胺氮芥在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的催化下，與谷胱甘肽形成水溶性復(fù)合物從尿液或膽汁中排出體外[4]。已有研究表明，GSTP1（rs1695）（下文簡(jiǎn)稱GSTP1）313位點(diǎn)由A突變?yōu)镚可影響GSTs的表達(dá)及活性，使環(huán)磷酰胺及其代謝產(chǎn)物的排泄減少，在體內(nèi)蓄積增加，導(dǎo)致患者療效及不良反應(yīng)之間出現(xiàn)差異[5-6]。本研究以接受CBV方案預(yù)處理化療的自體造血干細(xì)胞移植患者為研究對(duì)象，探討GSTP1 A313G基因多態(tài)性與患者血液學(xué)毒性之間的關(guān)系，旨在為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料來源與方法

1.1 病例資料

對(duì)2015年4月-2017年6月在北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受自體造血干細(xì)胞移植的淋巴瘤患者進(jìn)行回顧性分析，所有患者根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，經(jīng)病理活檢確診為淋巴瘤。按照Ann-Arbor淋巴瘤分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，將患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.2 治療方法

所有患者均給予大劑量預(yù)處理化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植治療。將患者自體造血干細(xì)胞回輸?shù)臅r(shí)間定義為第0天。預(yù)處理采用CBV方案：環(huán)磷酰胺 1.25 g/m2（-5～-2 d），卡莫司汀 300 mg/m2（-6 d），依托泊苷 200 mg/m2（-5～-2 d）。

1.3 DNA序列測(cè)定方法

采用熒光染色原位雜交檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。具體方法：抽取患者外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，取150 μL血加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min；使用Scilogex D2012型離心機(jī)離心5 min，棄上清，加入核酸純化試劑（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），混勻后加入相應(yīng)位點(diǎn)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），采用TL988A型雙通道實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司）檢測(cè)GSTP1 A313G位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.4 觀察指標(biāo)

查閱病例資料，統(tǒng)計(jì)患者Ⅳ度白細(xì)胞減少、Ⅳ度中性粒細(xì)胞減少、Ⅳ度血小板減少的發(fā)生率、發(fā)生時(shí)間以及白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板的植入時(shí)間。記錄患者貧血分級(jí)，以及是否發(fā)生粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱，并計(jì)算Ⅲ～Ⅳ度貧血的發(fā)生率。

根據(jù)2009年美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute， NCI）制定的不良事件通用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE， 4.0版）[9]，Ⅳ度白細(xì)胞減少定義為：白細(xì)胞計(jì)數(shù)<1×109 L-1；Ⅳ度中性粒細(xì)胞減少的定義為：中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.5×109 L-1；Ⅳ度血小板減少定義為血小板計(jì)數(shù)<25×109 L-1。白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板植入時(shí)間的定義為：從自體造血干細(xì)胞回輸開始白細(xì)胞計(jì)數(shù)連續(xù)3 d>4×109 L-1的第1天、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)連續(xù)3 d>0.5×109 L-1的第1天：從自體造血干細(xì)胞回輸開始血小板計(jì)數(shù)連續(xù)3 d>20.0×109 L-1的第1天（在此前1周內(nèi)未輸注血小板的前提下）。貧血判斷標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ度為血紅蛋白低于正常參考值下限且≥100 g/L，Ⅱ度為血紅蛋白<100且≥80 g/L，Ⅲ度血紅蛋白<80且≥65 g/L，Ⅳ度為血紅蛋白<65 g/L。粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱的定義為：中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.5×109 L-1，同時(shí)單次口溫超過38.3 ℃或超過38.0 ℃高于1 h。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)GSTP1 A313G基因型及等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，判斷等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P>0.05表示所研究群體符合Hardy-Weinberg平衡定律。其余計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

共有83例患者納入研究，其中男性59例、女性24例；中位年齡37歲（14～63歲）；診斷為霍奇金淋巴瘤24例、非霍奇金淋巴瘤59例（其中B細(xì)胞淋巴瘤48例、T細(xì)胞淋巴瘤11例）。確診時(shí)Ann-Arbor分期患者：Ⅰ期4例、Ⅱ期11例、Ⅲ期17例、Ⅳ期51例。35例（42.2%）存在盜汗、發(fā)熱和體質(zhì)量減輕的癥狀。患者基線資料見表1。

2.2 GSTP1基因多態(tài)性

83例患者GSTP1基因的313位堿基，A等位基因頻率為81.3%，G 等位基因頻率為18.7%。28例（33.73%）患者至少存在1個(gè)位點(diǎn)變異。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，P>0.05，說明各基因型頻率達(dá)到遺傳平衡，研究資料具有群體代表性，患者GSTP1基因型分布詳見表2。

2.3 基因多態(tài)性對(duì)血液學(xué)毒性的影響

83例患者均出現(xiàn)Ⅳ度白細(xì)胞減少及Ⅳ度中性粒細(xì)胞減少，79例患者（AA基因型52例、AG基因型24例、GG基因型3例）出現(xiàn)Ⅳ度血小板減少；48例患者（AA基因型31例、AG基因型15例、GG基因型2例）出現(xiàn)Ⅰ～Ⅱ度貧血，35例患者（AA基因型24例、AG基因型10例、GG基因型1例）出現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ度貧血；32例患者（AA基因型21例、AG基因型11例）出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱；AA基因型患者與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預(yù)處理后血液學(xué)毒性與GSTP1基因多態(tài)性的關(guān)系見表3。

AA基因型患者發(fā)生Ⅳ度白細(xì)胞、Ⅳ度中性粒細(xì)胞、Ⅳ度血小板減少的時(shí)間與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預(yù)處理后血液學(xué)毒性發(fā)生時(shí)間與GSTP1基因多態(tài)性的關(guān)系見表4。

可獲得白細(xì)胞植入時(shí)間、中性粒細(xì)胞植入時(shí)間、血小板植入時(shí)間資料的患者分別為80、83、30例。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，AA基因型患者白細(xì)胞植入時(shí)間、中性粒細(xì)胞植入時(shí)間、血小板植入時(shí)間與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預(yù)處理后干細(xì)胞植入時(shí)間與GSTP1基因多態(tài)性的關(guān)系見表5。

3 討論

GSTP1 A313G（Ile>Val）是目前研究較為廣泛的單核苷酸多態(tài)性之一，該突變與環(huán)磷酰胺療效及不良反應(yīng)之間的關(guān)系目前尚未得出一致結(jié)論。有研究認(rèn)為攜帶GSTP1 313等位基因G的患者，由于GSTP1酶活性下降，對(duì)環(huán)磷酰胺及其活性代謝產(chǎn)物的清除變慢，在導(dǎo)致臨床療效提高的同時(shí)，也顯著升高了骨髓抑制等不良反應(yīng)的發(fā)生率[10-11]。Islam MS等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在使用環(huán)磷酰胺+表柔比星+氟尿嘧啶方案化療的乳腺癌患者中，攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者的生存率高于AA基因型患者，但不同基因型患者之間的不良反應(yīng)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sugishita M等[13]在一項(xiàng)單中心回顧性研究中得出了相反的結(jié)論：在使用含環(huán)磷酰胺化療方案的乳腺癌患者中，GSTP1 AA基因型患者發(fā)生粒細(xì)胞缺乏性發(fā)熱的風(fēng)險(xiǎn)高于AG、GG基因型患者。Jamieson D等[14]的研究則表明，GSTP1基因多態(tài)性對(duì)環(huán)磷酰胺的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著影響。

目前尚無造血干細(xì)胞移植患者中的GSTP1基因多態(tài)性與環(huán)磷酰胺不良反應(yīng)相關(guān)性之間的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中，GSTP1 313位攜帶等位基因G的患者Ⅳ度骨髓抑制的發(fā)生時(shí)間早于AA基因型患者，白細(xì)胞、血小板植入時(shí)間均長(zhǎng)于AA基因型患者，未觀察到上述差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析可能的原因有以下幾點(diǎn)：環(huán)磷酰胺體內(nèi)代謝過程受CYP、GSTs等酶的影響，GSTP1僅為影響其體內(nèi)過程的多種酶之一；移植預(yù)處理方案除環(huán)磷酰胺外，還有卡莫司汀、依托泊苷兩個(gè)藥物對(duì)血液學(xué)毒性也會(huì)產(chǎn)生影響；自體造血干細(xì)胞移植患者所使用的預(yù)處理方案劑量強(qiáng)度較高，血液學(xué)毒性發(fā)生率高于普通化療方案，無法判斷GSTP1基因型與血液學(xué)毒性發(fā)生率之間的相關(guān)性。

本研究樣本量較小，下一步可設(shè)計(jì)前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究，增加樣本量，考察可能影響環(huán)磷酰胺體內(nèi)代謝及排泄的其他基因位點(diǎn)數(shù)據(jù)，排除混雜因素的影響，以期得出明確結(jié)論。

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（收稿日期：2017-11-07 修回日期：2018-02-01）

（編輯：鄒麗娟）