二維超高效液相色譜—飛行時間質譜聯用技術鑒定氯化琥珀膽堿原料藥中的雜質

陳紅 楊梅 張姮婕 袁銘 廉向金

中圖分類號 R954.2；R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0941-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.19

摘 要 目的：建立鑒定氯化琥珀膽堿原料藥中雜質的方法。方法：采用二維超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術。一維色譜柱為Hypersil GOLD C18，以緩沖液（含22 mmol/L戊烷磺酸鈉+50 mmol/L氯化鈉+5 mmol/L硫酸）為流動相A，以乙腈為流動相B，流動相A、B的體積比為95 ∶ 5，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為214 nm；二維色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，以0.1%氨水為流動相A，以乙腈為流動相B，采用梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為0.4 mL/min；離子化模式為ESI+，毛細管電壓為2.5 kV，離子源溫度為120 ℃，霧化氣溫度為450 ℃，霧化氣流速為900 L/h，采集模式為MSE。結果：通過一維液相色譜在氯化琥珀膽堿原料藥中檢出琥珀酸、琥珀酰氯（工藝中間體）及吡啶（試劑）等雜質；另有4個比較明顯的未知雜質，分別命名為雜質1、雜質2、雜質3、雜質4，其中尤以雜質2的表觀含量最高。通過二維液相色譜質譜聯用法推斷雜質2為脫氫琥珀酰單膽堿，雜質4為氯化琥珀酰單膽堿，雜質1、雜質3在質譜中均未被檢測到信號。結論：本研究建立了鑒定氯化琥珀膽堿原料藥中雜質的方法，其研究結果可用于評價氯化琥珀膽堿原料藥的質量。

關鍵詞 氯化琥珀膽堿；原料藥；雜質；二維超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the identification of impurities in succinylcholine chloride raw material. METHODS： Two-dimensional UPLC-QTOF-MS was adopted. One dimension chromatographic condition was Hypersil GOLD C18 column using buffer solution （22 mmol/L sodium pentanesulfonate+50 mmol/L sodium chloride+5 mmol/L sulphuric acid） as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B， volume ratio of mobile phase A to mobile phase B 95 ∶ 5， column temperature of 40 ℃， flow rate of 1.0 mL/min， detection wavelength of 214 nm. Two-dimension chromatographic condition was ACQUITY UPLC BEH C18 column using 0.1% ammonia as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B （gradient elution） with column temperature of 30 ℃ at flow rate of 0.4 mL/min. Ionization mode was ESI+ with capillary voltage of 2.5 kV， source temperature of 120 ℃， temperature of atomizing gas at 450 ℃， flow rate of atomizing gas at 900 L/h， acquisition mode of MSE. RESULTS： The succinic acid， succinyl chloride （intermediate）， pyridine （reagent） and other impurities were detected in succinylcholine chloride by one dimensional method of HPLC. Other 4 obvious unknown impurities were named impurity 1， impurity 2， impurity 3 and impurity 4， among which the apparent content of impurity 2 was the highest. Two-dimensional method of HPLC-QTOF-MS deduced that the impurity 2 was dehydrogenate succinylcholine chloride and impurity 4 was succinylcholine chloride. The impurity 1 and impurity 3 were not detected in mass spectrum. CONCLUSIONS： Establish method for the identification of impurity in succinylcholine chloride raw material， and the results of research are used for the evaluation of the quality of the succinylcholine chloride raw material.

KEYWORDS Succinylcholine chloride； Raw material； Impurity； Two-dimensional UPLC-QTOF-MS

氯化琥珀膽堿屬于去極化型肌松藥。1952年氯化琥珀膽堿注射液被批準在美國上市，1955年氯化琥珀膽堿注射液被批準在日本上市，我國于1959年開始生產氯化琥珀膽堿注射液。氯化琥珀膽堿注射液在臨床上用于全身麻醉時氣管插管術中維持肌松[1-7]，在現有肌松類藥物中起效最快[8]，屬于國家基本藥物目錄（2012年版）品種。氯化琥珀膽堿引起肌纖維去極化時使細胞內鉀離子迅速流至細胞外，可致血鉀水平升高、肌纖維成束收縮，常見不良反應有術后肌痛及眼壓、胃內壓、顱內壓升高等[9-15]，臨床上現已較少使用本品作為全麻快速誘導插管常規用藥。鑒于不良反應與藥品中雜質存在關系，且2015年版《中國藥典》（四部）未收載該原料藥雜質的鑒定方法，故本研究擬建立一種對其雜質進行鑒定的方法。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY 2D超高效液相色譜（UPLC）儀、Xevo G2-XS飛行時間質譜（QTOF）儀（美國Waters公司）；AE240電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli2Q去離子水發生器 （美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

氯化琥珀膽堿原料藥（A廠，批號：YE151102）；氯化琥珀膽堿[《美國藥典》（USP）對照品，批號：L1M438，純度：以無水物計為98.1%]；琥珀酰單膽堿（USP對照品，批號：H01364，純度：100%）；戊烷磺酸鈉（山東禹王實業有限公司化工分公司，批號：2014091401，色譜純）；氨水、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 氯化琥珀膽堿概述

氯化琥珀膽堿化學名：二氯化2，2′ -[（1，4-二氧代-1，4-亞丁基）雙（氧）]雙[N，N，N-三甲基乙銨]二水合物，英文名：Succinylcholine chloride，分子式：C14H30C12N2O4·2H2O，分子量為397.34。氯化琥珀膽堿為白色或類白色的結晶性粉末，無臭，在水中極易溶解，在乙醇或三氯甲烷中微溶，在乙醚中不溶，結構式見圖1。

根據氯化琥珀膽堿的理化性質，故參照USP40氯化琥珀膽堿項下有關物質檢查法（即“1D法”）的色譜條件對雜質進行初步分析，再采用二維色譜-質譜聯用法對其他未知雜質進行分析，結果見圖2。

2.2 方法

2.2.1 液相色譜（LC）/UPLC色譜條件（一維法，1D） 色譜柱：Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；檢測波長：214 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A：緩沖液（含22 mmol/L戊烷磺酸鈉+50 mmol/L氯化鈉+5 mmol/L硫酸），流動相B：乙腈，流動相A、B的體積比為95 ∶ 5。

2.2.2 LC/UPLC色譜條件（二維法，2D） 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；流動相A：0.1%氨水，流動相B：乙腈。洗脫程序：待吡啶雜質2出峰后，B相在3 min內由2%上升到60%。

2.2.3 質譜（MS）條件 離子化模式：電噴霧正離子化（ESI+）；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：120 ℃；霧化氣溫度：450 ℃；霧化氣流速：900 L/h；采集模式：全信息串聯質譜（MSE）。

2.2.4 樣品溶液的制備 取氯化琥珀膽堿原料藥約100 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈-水（50 ∶ 50，V/V）使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.5 測定法 取“2.2.4”項下的溶液適量，按“2.2.1”項下方法進樣50 μL，待吡啶雜質2出峰后按“2.2.2”項下色譜系統進行分離，同時將多個雜質峰按“2.2.3”項下進行質譜分析和結構確認。

2.3 結果

2.3.1 一維法（1D）實驗結果 氯化琥珀膽堿為季銨鹽，極性很強，在普通反相液相色譜中基本無保留，需在流動相中加入離子對試劑，以增加組分保留，達到更好的分離效果，結果見圖2。檢出琥珀酸、琥珀酰氯（工藝中間體）及吡啶（試劑）等雜質；另有4個比較明顯的未知雜質，分別命名為雜質1、雜質2、雜質3、雜質4，按面積歸一化法計算，其中尤以雜質2的表觀含量最高。

2.3.2 二維法（2D）與質譜聯用實驗結果 由于“1D”流動相含離子對試劑及不揮發的鹽，無法直接與MS連接進行雜質的鑒定，因此使用“2D”UPLC-QTOF系統來完成。考慮到氯化琥珀膽堿及其雜質極性很強，不易在普通色譜柱中保留，因此采用離子對試劑作為流動相（“1D”法），使雜質與主成分基本分離后，再將待測雜質切入“2D”UPLC-QTOF系統進行檢測分析。

為找到氯化琥珀膽堿雜質二級質譜的裂解規律，先對主成分氯化琥珀膽堿質譜圖進行分析，其一、二級質譜圖見圖3。二級質譜圖中主要碎片離子峰m/z為128.95、145.05、164.92、197.02，氯化琥珀膽堿質譜信號表現為琥珀膽堿部分，即[C14H30N2O4]2+，m/z為145，二級質譜碎片離子解析結果見圖4。

雜質4的保留時間約為10 min，分子離子峰m/z為204.123 5，通過軟件計算其分子式為[C9H18NO4]+，其一、二級質譜圖見圖5，二級質譜碎片離子解析結果見圖6。結果顯示，與氯化琥珀酰單膽堿對照品的質譜圖、分子式一致。

有關物質檢查表觀含量最高的雜質2的一、二級質譜圖見圖7，二級質譜碎片離子解析結果見圖8。

雜質2的分子離子峰m/z為202.107 5，通過軟件計算其分子式為[C9H16NO4]+，與氯化琥珀膽堿、氯化琥珀酰單膽堿二級質譜碎片匹配后，推測雜質2可能為脫氫琥珀酰單膽堿，實際在原料藥中以氯化物形式存在，結構式見圖9。

氯化琥珀酰單膽堿脫氫后共軛結構變長，讓雜質2的紫外吸收顯著增加，在214 nm波長處進行有關物質檢查時表觀含量非常大。經SciFinder、Reaxys數據庫查詢，尚未檢索到雜質2的毒理資料。通過對合成路線的分析，推測雜質2可能是由于起始原料丁二酸不純（丁二酸中所含丁二烯酸參與反應）產生的工藝雜質，而非降解雜質。

3 討論

氯化琥珀膽堿及其雜質極性很強，不易在普通色譜柱（C18）中保留，因此采用離子對試劑作為流動相，在使用一維色譜條件時，氯化琥珀膽堿及其雜質有較好的色譜保留和分離。由于采用離子對試劑作為流動相，無法直接與MS相連進行雜質的鑒定。因此，使用二維UPLC-QTOF系統來完成，二維色譜使用MS兼容的流動相與QTOF相連，將樣品中目標雜質切入二維色譜后再進入MS檢測。由于氯化琥珀膽堿及其雜質色譜保留不好，為避免進二維之前樣品被洗脫，切峰后未進行脫鹽處理全部進入MS。一維色譜的少量離子對試劑進入MS會產生離子抑制。因此，樣品中部分本身帶電荷的化合物可以被MS檢測到，而本身不帶電荷的化合物則由于離子抑制可能未被檢測到，雜質1、雜質3在MS中均未被檢測到信號。

液相系統2D 技術及QTOF系統，可解決不揮發鹽液相條件下雜質的定性問題，可以同時檢測多個雜質峰。本文主要檢測了雜質2和雜質4，分別得到一級和二級MS圖，并對其進行了解析，驗證了雜質4是氯化琥珀酰單膽堿，推測了雜質2分子式及結構，初步判定雜質2為脫氫氯化琥珀酰單膽堿。

本文采用一維色譜和二維UPLC-QTOF質譜聯用技術研究了氯化琥珀膽堿原料藥的雜質，研究結果對評價其質量有一定參考意義。

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（收稿日期：2018-01-02 修回日期：2018-02-12）

（編輯：余慶華）