壞損外擔菌改良培養(yǎng)基篩選

李繼業(yè) 趙晨心 彭麗娟

摘?要：壞損外擔菌（Exobasidium vexans）在PDA培養(yǎng)基上生長十分緩慢，影響后續(xù)研究。為篩選促進壞損外擔菌（E.vexans）生長的改良培養(yǎng)基。本文在PDA培養(yǎng)基中添加常用的4種碳源和4種氮源，配制16種培養(yǎng)基，初步確定培養(yǎng)壞損外擔菌（E.vexans）適宜的碳、氮源組合。再用正交試驗，確定碳、氮源用量與比例。結(jié)果顯示：碳源對壞損外擔菌（E.vexans）生長的影響大于氮源;有機氮比無機氮更適合其生長;最佳碳源、氮源為蔗糖+酵母粉，理論最佳培養(yǎng)基配方為酵母粉12 g/L、馬鈴薯150 g/L、蔗糖25 g/L。與PDA培養(yǎng)基比較，該菌在最佳培養(yǎng)基上生長速率快，菌絲更飽滿。

關(guān)鍵詞：茶餅病菌;正交試驗;培養(yǎng)基改良

中圖分類號：Q935

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0020-06?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.004

由壞損外擔菌（Exobasidium vexans）引起的茶餅病，主要危害茶樹（Camellia sinensis）的芽和葉，我國四大茶區(qū)均有分布。發(fā)病后葉片制成的茶葉，味道變差、葉片容易碎裂，品質(zhì)明顯下降[1]。發(fā)病時會在寄主葉片背部產(chǎn)生附著白色粉狀物質(zhì)的病斑，即為病原菌子實層，是由擔子、擔孢子聚集著生而成[2-4]。劉愛英等人[5]研究顯示，引起油茶餅病的細麗外擔菌（Exobasidium gracile）次生代謝產(chǎn)物中含有多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，對植物生長和發(fā)育有刺激作用;細麗外擔菌（E.gracile）與壞損外擔菌（E.vexans）屬于同屬親緣關(guān)系相近的種，具有潛在產(chǎn)生長調(diào)節(jié)劑的能力。對植物而言，植物生長調(diào)節(jié)劑不僅可以調(diào)控植物體內(nèi)核酸、酶以及蛋白質(zhì)的合成，還能對植物生長發(fā)育過程中的不同階段，如發(fā)芽、生根、細胞生長、器官分化、花芽分化、開花、結(jié)果、落葉、休眠等起到調(diào)節(jié)和控制作用[6-8]。如通過人工培養(yǎng)真菌獲得大量的對植物生長起到調(diào)節(jié)作用的次生代謝產(chǎn)物，可大大降低大田施用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的成本和減少對環(huán)境的污染[9-11]。目前國內(nèi)針對這類真菌的研究不多，本文通過在PDA培養(yǎng)基中添加不同碳、氮源，找出適合壞損外擔菌（E.vexans）生長的改良PDA培養(yǎng)基。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

壞損外擔菌（E.vexans）由貴州大學農(nóng)學院植物病理學實驗室分離、鑒定和保存[12]。

1.2?方法

先通過窮舉法找到最適碳源、氮源，然后結(jié)合正交法確定理論最佳培養(yǎng)基配比，最后按照理論最佳培養(yǎng)基制作改良培養(yǎng)基進行驗證。

1.2.1?窮舉法篩選病原菌生長最佳營養(yǎng)物質(zhì)

選擇常用的4種碳源和4種氮源，使用窮舉法，配制時分別選擇1種碳源和1種氮源，制成16種不同的培養(yǎng)基，劑量為制備真菌培養(yǎng)基常用劑量（見表1）。將壞損外擔菌（E.vexans）打成6 mm大小的菌餅，分別接種到16種配方的培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種配方為1個處理，每處理重復4次。對照培養(yǎng)基為PDA。測量每處理菌落平均直徑，每3 d測量1次。參考16種培養(yǎng)基上壞損外擔菌（E.vexans）生長15 d后的菌絲形態(tài)，菌絲色澤，菌絲密度，得到最優(yōu)培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)配方[13-14]。

1.2.2?正交試驗篩選最優(yōu)碳氮源用量

PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯浸出物不僅提供了碳源與氮源，還含有重要的微量營養(yǎng)成分，故將其用量作為改良培養(yǎng)基的一個因素來處理[15]。根據(jù)1.2.1粗篩選好的最優(yōu)配方（為酵母粉+馬鈴薯+蔗糖），設(shè)計正交試驗探索不同用量、不同比例的營養(yǎng)物質(zhì)對微生物生長的影響[16-17]。此正交試驗為3因素5水平，考慮采用一部分L25（56）正交表（使用SPSS軟件進行正交試驗設(shè)計），共設(shè)計25個處理（見表2，表3）。將壞損外擔菌（E.vexans）在PD液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5～7 d（轉(zhuǎn)速150 r/min，28℃），制成培養(yǎng)液，用移液器在不同處理的平板上加入1 μL菌液，每個處理重復4次，培養(yǎng)15 d后測量菌落直徑。

2?結(jié)果與分析

2.1?壞損外擔菌（E.vexans）菌落平均直徑

壞損外擔菌（E.vexans）在16種不同培養(yǎng)基上生長狀況見表4。壞損外擔菌（E.vexans）在第9 d時開始在5種培養(yǎng)基開始生長，在第15 d時菌落直徑最大的培養(yǎng)基是A2B1，即碳源為蔗糖，氮源為酵母粉的組合。不同碳源組在15 d時菌落平均直徑大小依次為：A2 > A3 > A1 > A4，可見A2（蔗糖）對其生長最為有利（表5）;不同氮源組在15 d時菌落平均直徑大小依次為：B1 > B4 > B3 > B2，可見B1（酵母粉）對其菌落生長最為有利（表6）。

2.2?壞損外擔菌（E.vexans）生長狀況

對壞損外擔菌（E.vexans）16種培養(yǎng)基上生長狀況見表7。在A1B1中菌落形態(tài)完整，菌絲色澤潔白，菌絲不密集;在A1B2中菌絲完整，菌絲色澤呈現(xiàn)米白色，菌絲不密集;在A1B3中菌絲形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲密度一般;在A1B4中菌落形態(tài)較完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲密度較高，在A2B1中菌落形態(tài)十分完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲密度極高;在A2B2中菌絲形態(tài)較完整，菌絲色澤潔白，菌絲密度較密;在A2B3中菌落形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲密度一般;在A2B4中菌絲形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲密度一般;在A3B1中菌絲形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲不密集;在A3B2中菌絲形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲較為密集;在A3B3中菌絲形態(tài)完整，菌絲色澤呈米黃色，在A3B4中菌絲形態(tài)不完整，菌絲色澤呈米黃色，菌絲不密集。在A4B1中菌絲形態(tài)完整菌絲色澤呈潔白，菌絲密度較高;A4B2菌絲形態(tài)較為完整色澤米黃色，菌絲密度一般;A4B3菌絲形態(tài)較為完整色澤米黃色，菌絲密度一般;A4B4菌絲形態(tài)較為完整色澤米黃色，菌絲不密集。

經(jīng)比較，A2B1培養(yǎng)基（碳源為蔗糖，氮源為酵母粉）上壞損外擔菌（E.vexans）菌絲密度最高。

2.3?不同配比碳氮源正交試驗結(jié)果

對正交試驗的結(jié)果（表8）用IBM SPSS Statistics 19軟件進行方差分析 （見表9）。P蔗糖=0.010≤0.01，P酵母=0.033≤0.05，P馬鈴薯=0.124>0.05，故蔗糖用量對菌落直徑的影響極顯著，酵母對菌落直徑的影響顯著，馬鈴薯對其影響不顯著。

正交試驗極差RC>RA> RB（見表8），3因素對壞損外擔菌（E.vexans）生長的影響從大到小依次為蔗糖 > 酵母 > 馬鈴薯。實驗中最佳組合為A2B2C3，菌落平均直徑為2.85 cm，其次為A4B5C3，菌落平均直徑為2.6 cm，二者比較接近。通過計算K值并比較，理論最佳水平組合為 A4B2C3。

按照理論最佳水平組合配制培養(yǎng)基（酵母12 g/L、馬鈴薯150 g/L、蔗糖25 g/L），相同條件下，理論最佳水平組合與實驗最佳組合培養(yǎng)基平板上加入1 μL菌液，每處理重復4次。培養(yǎng)15 d后測菌落直徑，菌落平均直徑分別為2.90 cm和2.85 cm，理論最佳水平組合菌落直徑略大于實驗最佳組合，但相差不大。故最佳培養(yǎng)基配方為：酵母12 g/L、馬鈴薯150 g/L、蔗糖25 g/L。

3?結(jié)論與討論

本文使用窮舉法，選擇葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖4種碳源，酵母粉、硫酸銨、硝酸銨和蛋白胨4種氮源，通過觀察壞損外擔菌（E.vexans）在16種不同培養(yǎng)基上菌落直徑和菌絲形態(tài)，得到最適合壞損外擔菌（E.vexans）生長的營養(yǎng)物質(zhì)組合為蔗糖和酵母粉。通過正交試驗，確定適宜該菌生長的碳源、氮源配比。

正交試驗結(jié)果顯示：蔗糖用量對菌落直徑的影響極顯著，酵母對菌落直徑的影響顯著，馬鈴薯對其影響不顯著;影響菌落生長的因素中，從大到小依次為蔗糖>酵母粉>馬鈴薯。在閆鴻媛[18]的研究中，常規(guī)食用菌培養(yǎng)碳源為主料，氮源為輔料，本實驗結(jié)果與其結(jié)果相符。方差分析結(jié)果顯示，馬鈴薯用量對菌落直徑?jīng)]有顯著性影響，推測是添加碳源和氮源在一定程度上削弱了馬鈴薯在改良培養(yǎng)基中的地位，但馬鈴薯在改良培養(yǎng)基中應繼續(xù)使用。因此，最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖25 g/L、酵母12 g/L、馬鈴薯150 g/L。

本實驗還進行了理論最佳培養(yǎng)基和實驗組最佳培養(yǎng)基的對比，結(jié)果顯示：理論最佳培養(yǎng)基A4B2C3略優(yōu)于實驗組最佳培養(yǎng)基A2B2C3，差別非常小，菌落直徑平均數(shù)僅相差0.05 cm。考慮到理論最佳培養(yǎng)基配方中酵母粉用量是實驗組最佳培養(yǎng)基的2倍，若大規(guī)模培養(yǎng)，實驗組最佳培養(yǎng)基A2B2C3更節(jié)約成本，即蔗糖25 g/L、酵母6 g/L、馬鈴薯150 g/L。

碳源是微生物培養(yǎng)基中重要的營養(yǎng)成分之一，是微生物代謝及生長的重要能量物質(zhì)來源。不同種類的碳源組成的培養(yǎng)基對壞損外擔菌（E.vexans）的生長速率有著不同的影響。潘武等[19]研究表明，碳源為蔗糖的培養(yǎng)基能夠促進稻曲病病原菌（Ustilaginoidea oryzae）的生長[18]。本文選用的4種碳源，壞損外擔菌（E.vexans）均可以利用，而蔗糖更利于菌絲生長和菌落擴大，與葡萄糖相比，蔗糖是促進部分真菌生長更好的碳源。正交試驗結(jié)果表明，碳源對其生長的影響大于氮源對其生長的影響。

微生物生長和繁殖過程中，氮源也是不可或缺的，用于合成核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。本實驗對有機氮和無機氮都進行了探索。壞損外擔菌（E.vexans）對有機氮與無機氮均可利用。A4組培養(yǎng)基為在PDA中添加了不同氮源，結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)時間內(nèi)菌落直徑均明顯大于對照（PDA培養(yǎng)基），表明添加氮源可促進其生長（見表4處理13～17）。不同氮源對壞損外擔菌（E.vexans）菌落生長影響不一樣，在碳源相同的同組實驗中比較15 d時菌落平均直徑和菌絲密度，酵母粉和蛋白胨這2種有機氮源對壞損外擔菌（E.vexans）菌落生長影響高于無機氮源，含有機氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長更為迅速（見表6）;2種無機氮源，壞損外擔菌（E.vexans）生長速率硫酸銨高于硝酸銨。

參?考?文?獻：

[1]?陳雪芬.一個世紀來的茶餅病[J].國外農(nóng)學（茶葉），1984，（1）：1-6.

[2]?蒲國濤.茶樹茶餅病防治研究進展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2015，61（5）：79-81.

[3]?戚利潮，張葉大.茶樹主要病害及其防治[J].茶葉，2016，42（1）：10-12.

[4]?王紹梅，宋文明.茶餅病的發(fā)生規(guī)律與綜合防治[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2012（4）：45-46.

[5]?劉愛英，梁宗琦，康冀川.茶餅病菌分生孢子階段分離培養(yǎng)極其發(fā)酵液對植物的刺激作用[J].菌物系統(tǒng)，2002，21（3）：437-439.

[6]?周欣欣，張宏軍，白孟卿，等.植物生長調(diào)節(jié)劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及前景[J].農(nóng)藥科學與管理，2017，38（11）：14-19.

[7]?胡桂萍，劉?波，石旭平，等.微生物資源在茶產(chǎn)業(yè)中的應用現(xiàn)狀及展望[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，6（4）：1205-1211.

[8]?彭麗娟，孫?濤，劉永翔，等.油茶茶苞病菌的分離與鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2010，38（12）：147-149.

[9]?王莉蕊.灰樹花胞外多糖的分離純化及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D].天津：天津科技大學，2014.

[10]?郭?勤，高?楠，汪?勇，等.我國茶樹農(nóng)藥應用現(xiàn)狀及問題分析[J].中國植保導刊，2014，34（8）：58-61.

[11]?許耀照，孫柏林，曾秀存.植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)作物上的利用研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2017，63（5）：77-80.

[12]?韋思梅，彭麗娟.抑制茶餅病菌放線菌及細菌的篩選與鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2015，43（1）：73-76.

[13]?趙赟鑫，張?歡，鄧百萬，等.紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（11）：389-392.

[14]?董玲玲，李志軍，田?毅，等.綠色木霉液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].釀酒科技，2010（2）：27-30.

[15]?郝士海.現(xiàn)代細菌學培養(yǎng)基和生化試驗手冊[M].北京：中國科學技術(shù)出版社，1992（1）：12-20，66-94.

[16]?陳?哲，梁?宏，黃?靜，等.解淀粉芽孢桿菌CM3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2016，44（11）：1577-1583.

[17]?高?東，楊清華，吳蒙蒙，等.正交法提取茶多酚及其體外抗氧化作用[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2012，33（2）：74-77.

[18]?閆鴻媛.食用菌培養(yǎng)基配制及滅菌技術(shù)[J].蔬菜，2017（5）：63-64.

[19]?潘?武.稻曲病菌生物學特性及病害流行研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2008.