冰片修飾的秋水仙堿醇質體的制備及體外擴散性評價

張楠 宋輝 汪志強 張宇佳 鄭穩生

中圖分類號 R944 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0902-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.09

摘 要 目的：制備冰片修飾的秋水仙堿醇質體，并評價其體外擴散效果。方法：采用超聲注入-探頭超聲法制備冰片修飾的秋水仙堿醇質體，并對其進行表征。采用氣相色譜法測定冰片含量并計算其在醇質體中修飾率；高效液相色譜法測定秋水仙堿含量并計算其在醇質體中的包封率。分別考察秋水仙堿乙醇溶液、秋水仙堿-冰片乙醇溶液、未加冰片修飾的秋水仙堿醇質體和冰片修飾的秋水仙堿醇質體經皮擴散1、3、6、8、12、16、24、48 h 后的累積滲透量和滲透速率。結果：所制冰片修飾的秋水仙堿醇的平均粒徑約為（110.4±5.1） nm，多分散系數為0.110±0.030，Zeta電位為（2.33±0.20） mV，形狀近似球形，為多層囊泡結構，秋水仙堿包封率為56.12%，冰片修飾率達9.85%。體外擴散試驗表明冰片修飾的秋水仙堿醇質體經皮擴散48 h后的單位面積累積滲透量為103.52 μg/cm2，滲透速率分別是未加冰片修飾的秋水仙堿醇質體的1.26倍、秋水仙堿-冰片乙醇溶液的1.77倍、秋水仙堿乙醇溶液的5.14倍。結論：制備的冰片修飾的秋水仙堿醇質體粒徑小、粒徑分布窄、冰片修飾率高，且經皮滲透效果良好。

關鍵詞 秋水仙堿；冰片修飾；醇質體；制備；修飾率；體外擴散；包封率；累積滲透量

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare borneol-modified colchicine ethosome， and to evaluate its in vitro transdermal permeation. METHODS： Borneol-modified colchicine ethosome was prepared with ultrasonic injection-probe ultrasonic method， and its ethosome was characterized. The content and moditication rate of borneol in borneol-modified colchicine ethosome was determined by GC； content and encapsulation rate of colchicine was determined by HPLC. Accumulative permeability and permeation rate were investigated for colchicine ethanol solution， colchicine-borneol-ethanol solution， colchicine ethosome without borneol-modification， borneol- modified colchicine ethosome after diffused for 1， 3， 6， 8， 12， 16， 24， 48 h. RESULTS： The average particle size of borneol- medified colchicine ethosome was about （110.4±5.1） nm， polydispersity index was 0.110±0.030， Zeta potential was （2.33±0.20） mV， prepared ethosome is approximately spherical in shape and multilaminar vesicles in structure. Encapsulation rate of colchicine was 56.12%， and modification rate was 9.85%. The in vitro diffusion tests showed that after diffused for 48 h， accumulative permeability per unit area of borneol-modified colchicine ethosome was 103.52 μg/cm2； permeation rate was 1.26 times as colchicine ethosome without borneol-modification， 1.77 times as colchicine-borneol-ethanol solution and 5.14 times as colchicine ethanol solution. CONCLUSIONS： Prepared borneol-modified colchicine ethosome has small particle size， narrow particle size distribution， high modification rate and good transdermal permeation.

KEYWORDS Colchicine； Borneol-modified； Ethosome； Preparation； Modification rate； in vitro diffusion； Encapsulation rate； Accumulative permeability

秋水仙堿（Colchicine）是適用于肝、腎功能正常，但不能使用非甾體抗炎藥的痛風患者的特效藥。但其治療痛風急性發作的毒性較大、治療指數狹窄，目前國內市售劑型只有普通片劑，每日服藥次數多、服藥方法復雜、口服后血藥濃度波動較大。經皮給藥能夠避免肝的首關效應和胃腸道刺激，在實現無創給藥的同時能隨時中斷給藥，提高了藥物生物利用度和患者的依從性。此外，經皮給藥具有緩釋作用，可減少給藥次數，并能維持血漿中藥物濃度長時間處于治療窗內[1]。可見，秋水仙堿經皮劑型的研究可以改善其嚴重不良反應的發生，具有重大的臨床意義。

然而，由于皮膚角質層的存在，大多數藥物無法滲透入皮膚。因此，需要應用多種促滲技術來擴大經皮給藥的用藥范圍，其中包括制備脂質體等新型遞送載體。但是，由于傳統意義上的脂質體攜帶藥物深入滲透過皮膚的效果并不理想，需要獨特設計的載體才能達到通透皮膚的目的[2]。醇質體是近十幾年來在脂質體的基礎上發展起來的一種新型制劑，即是一種含有高濃度的醇類（乙醇、丙二醇或異丙醇或其混合物）的脂質體。已有較多報道證明，相比于普通的脂質體，醇質體具有制備方法簡單、穩定性高、粒徑小、透皮效率高、顯著促進藥物進入皮膚深層、無明顯刺激性等優點，是具有較大開發和應用前景的新型透皮給藥系統[1-3]。

冰片（Borneol）是一種小分子脂溶性單萜類中藥，已被報道與多種中藥配伍使用時可以促進藥物透過生物性屏障以達到藥物在機體內的最佳分布和吸收。筆者根據冰片能夠打開角質層的作用[3]，制備了冰片修飾的醇質體，采用氣相色譜法測定其中冰片的含量并計算修飾率，以評價其體外透皮效果，為秋水仙堿經皮給藥制劑的開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器

SCIENTZ超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；7820A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；2487&2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；H7650透射電子顯微鏡、TM4000臺式掃描電鏡（日本日立有限公司）；Nano ZSP系列激光散射粒度儀（英國Malvern儀器公司）；TP-6智能透皮試驗儀（天津市鑫洲科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

秋水仙堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101176-201202，純度：93.6%）；秋水仙堿原料藥（武漢神曲生物化工有限公司，批號：201402，純度：≥98%）；蛋黃卵磷脂[艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司，批號：AL1508，純度：98%]；冰片（江西雪松天然藥用油有限公司，批號：E1620105，純度：97%）；試驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD 大鼠6只，♂，體質量（200±10） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。

2 方法與結果

2.1 冰片修飾醇質體的制備和表征

2.1.1 醇質體的制備 分別稱取160 mg蛋黃卵磷脂、16 mg冰片+160 mg蛋黃卵磷脂、16 mg冰片+16 mg秋水仙堿原料藥+160 mg蛋黃卵磷脂，溶于3.04 mL乙醇中，在密閉條件下以20 mL/h的速度分別注入5.44、5.42、5.40 mL水，25 ℃下超聲（250 W，40 kHz）15 min，并將得到的液體在冰浴下探頭超聲（150 W，50 Hz，超聲2 s間隙3 s）5 min，0.22 μm濾膜過濾，分別制得空白醇質體（BLANK-ES）、冰片修飾的空白醇質體（BLANK-bES）、冰片修飾的秋水仙堿醇質體（COL- bES）[4]。

2.1.2 粒徑和Zeta電位的測定 取“2.1.1”項下BLANK- ES、BLANK-bES、COL-bES，用純凈水按體積比為1 ∶ 1稀釋后，使用Nano ZSP系列激光散射粒度儀測定其粒徑和Zeta電位。結果，BLANK-ES、BLANK-bES、COL- bES的平均粒徑分別為（104.9±3.4）、（109.9±4.7）、（110.4±5.1） nm（RSD分別為3.2%、4.3%、4.6%，n=3），多分散系數（PDI）分別為0.072±0.02、0.132±0.021、0.110±0.030（RSD分別為27.8%、15.9%、27.2%，n=3），Zeta電位分別為（1.86±0.64）、（2.04±0.29）、（2.33±0.20） mV（RSD分別為6.53%、14.2%、8.6%，n=3）。結果表明，所制備的醇質體粒徑較小，且粒徑分布范圍較窄。COL-bES的粒徑和電位分布圖見圖1。

2.1.3 形態觀察 吸取制備的COL-bES溶液少許滴于有支持膜的銅網上，用濾紙吸銅網邊緣多余液體，待稍干后，采用透射電鏡和掃描電鏡觀察樣品形態。結果顯示，所制備COL-bES與文獻報道[5]一致，形狀近似球形，為多層囊泡結構，具備典型醇質體的結構，詳見圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 BLANK-bES、BLANK-ES、COL-bES破乳液 精密量取BLANK-bES、BLANK-ES、COL-bES各0.1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇超聲破乳并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 冰片對照品溶液 精密稱取5 mg冰片，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 冰片含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜條件按照2015版《中國藥典》（一部）方法[6]并按文獻[7]進行優化。色譜柱：DB-WAX（30.0 m×320 μm×0.15 μm）；檢測器：火焰離子檢測器（FID）；柱溫：130 ℃；檢測器溫度：250 ℃；分流比：50 ∶ 1；載氣：N2，40 mL/min；尾吹：20 mL/min；柱流速：1.0 mL/min；進樣量：1 μL；進樣口溫度：200 ℃。

2.3.2 專屬性考察 取冰片對照品溶液、BLANK-bES和BLANK-ES破乳液各1 μL，按“2.3.1”項下條件進樣測定。結果，冰片的出峰時間為3.09 min，醇質體脂質未出峰，對冰片測定無影響，色譜圖見圖3。

2.3.3 線性關系考察 精密稱取冰片50.32 mg，置于10 mL量瓶中，無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備液。取適量貯備液分別制成質量濃度為10.64、53.20、106.40、266.00、532.00、1 064.00、5 320.00 μg/mL的供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以冰片質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=1.795x-33.78（R2=0.999 8）。表明冰片檢測質量濃度線性范圍為10.64～5 320.00 μg/mL。

2.3.4 方法學考察 按照相關要求進行操作，分別考察精密度、穩定性與準確度。結果，精密度試驗的RSD為1.35%（n=6），8 h穩定性試驗的RSD為1.5%（n=6），平均加樣回收率為100.10%（RSD=0.53%，n=9），均符合相關要求。

2.4 COL-bES中冰片修飾率的測定

按照“2.1.1”項下方法制備3批COL-bES。各吸取100 μL置于已脫水的G15葡聚糖凝膠微柱上，每管使用200 μL純凈水洗脫，收集前5管洗脫液至洗脫液中無乳光，將洗脫液合并為1管，加入5 mL無水乙醇超聲（250 W，40 kHz）30 min破乳[8]，隨后使用無水乙醇定容至10 mL量瓶中。精密量取上述溶液1 μL，按“2.3.1”項下條件進樣測定，計算冰片修飾率[冰片修飾率（%）=洗脫液中冰片的質量/總卵磷脂質量×100%]。結果，3批COL-bES中冰片的平均修飾率為9.85%（RSD=0.8%，n=3），與冰片的理論修飾率（10%）接近，表明本試驗制備的醇質體冰片修飾率高，冰片幾乎無損失。

2.5 秋水仙堿的含量測定

2.5.1 色譜條件及系統適用性試驗 色譜柱：Intersil C-8（250 mm×3.0 mm，3 μm）；流動相：45%甲醇溶液；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，取“2.2”項下BLANK-bES破乳液和COL-bES破乳液進樣測定。結果，理論板數以秋水仙堿計為5 000，分離度較好，色譜圖見圖 4。

2.5.2 線性關系考察 稱取0.025 g秋水仙堿對照品于25 mL量瓶中，加適量水超聲至完全溶解，加水定容，往復振蕩至完全混勻，得秋水仙堿質量濃度為1 mg/mL的貯備液。取貯備液加水分別制成質量濃度為500、200、100、50、20、15、10、5、2 μg/mL的供試品溶液。按照“2.5.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以秋水仙堿質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=73 905x+1 485.2（R2= 0.999 9），表明秋水仙堿檢測質量濃度線性范圍為2～500 μg/mL。

2.5.3 方法學考察 按照相關要求進行操作，分別考察精密度、穩定性與準確度。結果，日內、日間精密度試驗的RSD分別為1.45%、1.50%（n=6），24 h穩定性試驗的RSD為1.21%（n=6），平均加樣回收率為99.71%（RSD=1.43%，n=9），均符合相關要求。

2.6 COL-bES包封率的測定

吸取100 μL COL-bES置于已脫水的G15葡聚糖凝膠微柱上，每管使用200 μL純凈水洗脫，收集前5管洗脫液至洗脫液中無乳光，將洗脫液合并為1管，加入5 mL無水乙醇超聲（250 W，40 kHz）30 min破乳，隨后使用無水乙醇定容至10 mL量瓶中，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算洗脫液中秋水仙堿的濃度和包封率[包封率（%）=洗脫液中秋水仙堿的質量/總秋水仙堿質量×100%]。結果，COL-bES的平均包封率為56.12%（n=3）。

2.7 冰片修飾的秋水仙堿醇質體的體外擴散評價

2.7.1 離體鼠皮的制備 取6只SD大鼠，用小動物專用脫毛膏進行腹部脫毛，脫毛后并用生理鹽水洗凈，飼養24 h后，用手術刀剝離腹部皮膚，分離皮下組織和脂肪，剃毛器再次剔除毛發，選用無破損皮膚浸泡于生理鹽水中，置于4 ℃冰箱中保存，備用，24 h內使用。

2.7.2 大鼠體外透皮試驗 取預先制備好的離體鼠皮，固定于雙室擴散池之間，角質層面向供給池，裁剪掉多余面積的鼠皮，使用接收池加滿生理鹽水作為接收液，排空氣泡，平衡30 min后更換接收液，供給池內分別加入秋水仙堿乙醇溶液（最終乙醇體積分數為36%）、秋水仙堿-冰片乙醇溶液（最終乙醇體積分數為36%）、未經冰片修飾的秋水仙堿醇質體（COL-ES）、COL-bES各3份，保證每份中秋水仙堿質量濃度一致，每份加至供給池正好被填滿（7 mL）；接收池加入7 mL生理鹽水。用小磁粒不斷攪拌接收液以確保藥物均勻分散，分別于1、3、6、8、12、16、24、48 h 測定藥物透皮量。每個時間點從接收池取樣1 mL，同時取出同體積新鮮接收液加入到接收池中進行稀釋校正，按照“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，計算秋水仙堿的累積滲透量（M） [M=[∑][i=1][n]CiV/A，其中n為取樣次數，Ci（μg/mL）為第i（i=1、3、6、8、12、16、24、48）h時取樣液的質量濃度，V為接受池容積（7 mL），A為透皮擴散面積（2.01 cm2）][4，8]和擴散速率（J，J=M/t，t為透皮時間）[9]，M-t曲線見圖5。

2.7.3 皮內滯留量的確定 48 h后，取下皮膚用水洗凈，剪下用藥部位，并用75%乙醇棉球擦干皮膚表面，剪碎皮膚，加入10 mL無水乙醇，超聲提取，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后，取續濾液按“2.5.1”項下條件進樣測定濃度，并計算總質量，計算單位面積皮內的滯留量[4]。相關經皮滲透參數見表1。

結果表明，累積滲透量以及單位面積皮內滯留量大小順序均為COL-bES>COL-ES>秋水仙堿-冰片乙醇溶液>秋水仙堿乙醇溶液。48 h內COL-bES的J是秋水仙堿乙醇溶液的5.14倍，是秋水仙堿-冰片乙醇溶液的1.77倍，是COL-ES的1.26倍。

3 討論

醇質體作為一種新型脂質類給藥載體，其促進經皮滲透效果要明顯優于其他脂質類載體[10-11]。雖然相比于脂質體，醇質體由于含有高濃度的醇，藥物易泄露[12]，但醇質體的包封率大小對其滲透效果并無明顯影響。

本試驗中使用的超聲注入-探頭超聲法是在既往研究[5，13-17]基礎上進行改進后所得。前期試驗表明，超聲注入所得醇質體粒徑要小于磁力攪拌注入法，采用探頭超聲法后在進一步降低粒徑的同時，能夠降低醇質體的PDI，使粒徑范圍變窄。筆者有前期研究中篩選了柱溫、檢測器溫度、進樣器溫度和分流比等多個氣相色譜條件，發現柱溫對冰片出峰有明顯的影響。當柱溫超過150 ℃時，冰片的峰形會分裂，因此最終選擇了130 ℃的柱溫。在前期研究中發現，冰片濃度過高會影響醇質體的穩定性，通過篩選發現當冰片占總體系質量的0.2%時，對醇質體的粒徑和穩定性無明顯影響；同時有文獻表明[18]，當冰片占脂質總量的10%左右時，具有促進藥物滲透的效果。因此本研究中冰片占總體系質量的0.2%，脂質占總體系質量的2%。本試驗中COL-bES體系內的乙醇和冰片都是傳統的經皮促滲劑。為確定COL-bES系統的促滲效果，本試驗選擇秋水仙堿乙醇溶液和秋水仙堿-冰片乙醇溶液作為對照，試驗證明，在含有相同體積分數乙醇的情況下，醇質體的滲透效果要遠強于乙醇溶液，而冰片修飾的醇質體滲透效果要優于無修飾的醇質體滲透效果。

綜上，本研究選用冰片來修飾醇質體，具有良好的修飾效果，且能夠有效地促進醇質體攜帶藥物透入皮膚，有良好的研究前景。

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（收稿日期：2017-08-23 修回日期：2018-01-25）

（編輯：劉明偉）