產β葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

童愛均 趙超 曾峰

摘 要：β葡萄糖苷酶是纖維素分解酶系中的重要組成部分，具有廣泛的應用前景。以牛瘤胃為材料，篩選得到4株β葡萄糖苷酶產生菌株，采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測定各菌株的β葡萄糖苷酶酶活力，選取1株β葡萄糖苷酶酶活力較高的菌株，結合16S rDNA序列分析方法對其進行分子生物學鑒定。結果表明：篩選到1株產β葡萄糖苷酶活力為6.589U·mL-1的菌株命名為TA1；經鑒定該菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens）。研究結果對產β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取具有一定的借鑒意義。

關鍵詞：β葡萄糖苷酶；16S rDNA序列；分子生物學鑒定

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.002

Abstract： βglucosidase is an important component of the cellulolytic enzyme system and has broad application prospects. Four βglucosidaseproducing strains were screened from bovine rumen， and the enzymatic activity of βglucosidase was determined by 3，5dinitrosalicylic acid （DNS） method， seletcted a strain which had high βglucosidase activity，and the molecular biology of strain was identified by 16SrDNA sequence analysis. The results showed that an obtained strain with enzyme activity of6.589U·mL-1was named TA1. This strain which was identified to be Serratia liquefaciens. The research results have certain reference significance for the acquisition of microbial resources for producing βglucosidase.

Key words： βglucosidase； 16S rDNA sequence； identification by molecular biology

β葡萄糖苷酶是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷酶鍵生成葡萄糖的纖維素水解酶類[1]。β葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動物、微生物等各種生物體內[2-5]。β葡萄糖苷酶是降解纖維素的主要組分之一，在纖維素降解中起著非常重要的作用[6-9]。因此，篩選高產β葡萄糖苷酶的微生物對纖維素有效降解具有重要意義。β葡萄糖苷酶被廣泛應用于食品、飼料、加工工業和醫療等領域[10-12]。在食品工業中，β葡萄糖苷酶主要用于改良果汁風味[13]。但目前β葡萄糖苷酶活力偏低，本研究以獲取高產β葡萄糖苷酶的菌株為目的，從牛瘤胃中篩選得到1株β葡萄糖苷酶的產生菌株，為產β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌體和菌種 菌體：牛瘤胃的提取液；工程菌：本實驗室保存的E.coli DH5α。

1.1.2 主要試劑 K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、NH4Cl、NaCl、FeSO4、瓊脂、葡萄糖為國產分析純或化學純，DNA分子標準品和PCR有關試劑為上海生工生物工程有限公司生產。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺（SWOJFD），蘇州凈化設備有限公司；電熱鼓風干燥箱（DHG9240A），上海恒一科學儀器有限公司；隔水式恒溫培養箱（GSP9160M），上海博訊實業有限公司；全溫振蕩器（ZHWY211B），上海智城分析儀器設備有限公司；高壓滅菌鍋（G180TW），美國致微（廈門）儀器有限公司；超純水系統（明澈TMD），Merck millipore有限公司；低速離心機（SC3612），上海雙旭電子有限公司；高速冷凍離心機（Avanti），Beckman 公司；PCR儀（PC814A），日本ASTEC公司；電泳儀（PROTBANIIXI2D），BIORAD 公司；凝膠成像系統（FIREREADER V4），UVITEC公司；電子天平（ME204E），梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 培養基

初篩培養基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1，KH2PO4 0.75 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.4g·L-1，NH4Cl 0.9 g·L-1，NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL ，羧甲基纖維素鈉（簡稱CMC）1%，pH值為6.0，1.6%瓊脂，高壓滅菌（121℃，20 min），倒平板備用。

發酵培養基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1， KH2PO4 0.75 g·L-1， MgCl2·6H2O 0.4 g·L-1， NH4Cl 0.9 g·L-1， NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL， CMC 1%，pH值為6.0，高壓滅菌（121℃，20 min），備用。

1.3 試驗方法

童愛均等：產β葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定2018年第7期

2018年第7期童愛均等：產β葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.3.1 菌株的初篩 取牛瘤胃1 mL于50 mL液體培養基放在37℃空氣恒溫搖床培養3 d后，培養后的菌液稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6懸濁液，取稀釋后的菌液1 mL于初篩培養基中進行培養，溫度為37℃，時間為3 d。將培養后的平板挑取單菌落再次劃線純化，直到獲得純菌落為止。將分離得到的純菌株點到初篩培養基上培養3 d后用1

mg·mL-1的甘果紅溶液染色20 min，倒掉染色液后用1mol·L-1NaCl 溶液脫色30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選菌株的標準，再將篩選到的菌株進行復篩。

1.3.2 菌株的復篩 將初篩得到的菌株按5%的接種量接種到液體發酵培養基中于37℃、120r·min-1，振蕩培養3 d。取發酵液，于4℃、8000r·min-1離心20 min去菌體，取其上清液用DNS法測定β葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力最高且穩定的菌株。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的制作 準確稱取100 mg分析純葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后，定容至100 mL，濃度為1mg·mL-1。各試劑用量列于表1。

將各管溶液混勻后，在沸水浴中加熱10 min，然后取出，立即用流動水冷卻至室溫，分別用蒸餾水定容至10 mL并搖勻。于540 nm處測吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 DNS法測定酶活力 吸取粗酶液0.5 mL，加入經30℃保溫10 min、含1%CMC、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液1.5 mL，30℃保溫30 min。然后加入3 mLDNS液，放入沸水浴中煮沸10 min后，迅速用流動水冷卻至室溫，再用蒸餾水定容至10 mL（DNS為鈍化酶活做空白對照）。1 h內用可見分光光度計在540 nm處比色測定。測量得到的數據代入由標準曲線測量值計算出來的回歸方程，在由回歸方程計算出相應的被測酶液所含葡萄糖量，根據酶活力計算公式算出酶活力大小。酶活力定義為上述條件下，1 mL發酵液1 min催化底物生成1 umol還原糖（以葡萄糖量計）為1個酶活力單位U，酶活力計算公式：U=（B×n/T×V）×v×1000/180

式中U：葡萄糖酶活力（U·mL-1），B：從標準曲線得到的凈葡萄糖含量，n：酶液稀釋倍數，v：酶和底物反應體積（mL），1000mg·ug-1，T：酶和底物反應時間（min），V：測定時稀釋酶液體積（mL），180：葡萄糖分子量。

1.3.5 菌株分子生物學鑒定

1.3.5.1 總DNA提取 隨機選取篩選出的單菌株，在發酵培養基上培養48 h，然后用CTAB/NaCl少量提取法提取。

1.3.5.2 目的基因片段PCR擴增 利用通用擴增16SrRNA基因的引物27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′，以基因組DNA為模板，進行PCR反應。設計PCR的體系為25 μL，其中ddH2O 15.5 μL，5×PCR緩沖液 5.0 μL，dNTP2.0 μL，引物0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶 0.5 μL。其中PCR擴增參數為：首先95℃預變性3 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，35個循環，最后在72℃延伸10 min，12℃終止反應。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。

1.3.5.3 重組質粒的構建和鑒定 PCR產物用膠回收試劑盒回收，連接PMD18T載體后，轉化大腸桿菌E.coliTop10，菌落PCR檢測陽性克隆子。

1.3.5.4 陽性克隆的驗證 質粒的提取：從16SrDNA文庫中隨機挑取30個克隆子分別接種于含有20mg·mL-1Amp+的5 mL LB培養液中，與200 r·min-1搖床37℃下培養12 h，采用上海生工Sanprep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，提取步驟參見試劑盒說明書。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察質粒提取結果。

重組質粒酶切驗證：按質粒DNA 8 uL，EcoRⅠ 1 uL，Hind Ⅲ1 uL ，Buffer（10×）2 uL，ddH2O 8 uL體系于37℃水浴反應3～5 h。水浴后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切驗證的結果。酶切成功后送生工生物工程（上海）有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 菌種平板的初篩

將分離得到的純菌株點到初篩培養基上培養3 d后用1 mg·mL-1的甘果紅溶液染色20 min，倒掉染色液后用1 mol·L-1 NaCl 溶液脫色30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值大小作為篩菌的標準。試驗結果表明，有4株菌株能夠產生水解圈。將得到的4株菌株能夠產生水解圈單菌落進行復篩。圖1為某個菌株初篩在平板上得到的水解透明圈。

2.2 復篩結果

2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 從葡萄糖標準曲線圖（圖2）可見，葡萄糖含量與其吸光值呈良好的線性函數關系，其函數關系式為y=0.4982x-0.0171，式中的y表示OD值，x表示葡萄糖含量，R2=0.997，表明線性關系良好，可以用作標準曲線。

2.2.2 酶活力復篩 將初篩得到的菌株用DNS法測β葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力最高且穩定的菌株。用DNS法測定β葡萄糖苷酶活力得到的結果如圖3所示。由圖3可以看出，1號菌株的酶活力最高，為6.589 U·mL-1。通過復篩獲得的1號菌株其產β葡萄糖苷酶酶活力較高，并對其進行反復培養，證明其產酶特性較為穩定。因此，將該菌株命名為TA1，并對其進行分子生物學鑒定。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 16SrDNA PCR擴增及克隆結果 利用通用擴增16SrRNA基因的引物27F對菌株TA1進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果，TA1 16SrDNA PCR擴增結果如圖4所示。PCR產物用膠回收試劑盒回收，連接PMD18T載體后，轉化大腸桿菌E.coliTop10，菌落PCR檢測陽性克隆子。從16SrDNA文庫中隨機挑取30個克隆子，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察質粒提取結果。再通過重組質粒酶切驗證表明獲得的擴增產物酶切成功。

2.3.2 菌株16SrDNA序列測定 將酶切成功后的擴增產物送至上海生工生物公司進行序列測定。菌株TA1的16SrDNA序列長度為1597 bp，將測序得到的序列后期用NCBI數據庫進行比對。其具體序列信息為見圖5。

2.3.3 同源性分析以及系統發育樹 將測序得到的序列用NCBI數據庫進行比對，下載與目標菌株序列同源性較高的菌株14株，運用MEGA5.0軟件以NJ計算方法生成系統發育進化樹，結果如圖6所示。其同源性高達99%，表明鑒定的菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens） 。

3 結論

通過剛果紅染色鑒定產β葡萄糖苷酶菌是一種快速簡便的篩選方法，透明圈直徑和菌落直徑大小的比值能夠直接反應菌落產β葡萄糖苷酶的能力。本研究以牛瘤胃為材料，通過初篩得到4株β葡萄糖苷酶產生菌株，采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測定β葡萄糖苷酶酶活力，得到1株酶活力為6.589 U·mL-1的菌株命名為TA1。經16SrDNA分子生物學鑒定，該菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens）。研究結果對產β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取具有一定的借鑒意義。

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（責任編輯：林玲娜）