雙孢蘑菇產(chǎn)、質量性狀相關分子標記的初步研究

王翠 郭仲杰 尤潔

摘 要：對206個收集自世界各地的雙孢蘑菇栽培菌株的總DNA進行大規(guī)模的SRAP、ISSR和RAPD分析，共獲得15條SRAP、3條ISSR和2條RAPD特異性標記條帶。利用這20個標記條帶對206個菌株中的具有代表性的3種不同農(nóng)藝性狀的131個菌株進行統(tǒng)計和分析，獲得標記和相關性狀的相關性。結果表明：試驗共篩選到5個與雙孢蘑菇質量性狀明顯相關的標記SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100；3個與雙孢蘑菇產(chǎn)量性狀明顯相關的標記SRAP23400 、SRAP2

41200 、SRAP231800。研究獲得的分子標記經(jīng)下一步的驗證，有望作為雙孢蘑菇的雜交育種過程中高產(chǎn)、優(yōu)質菌株篩選預測的特異性分子標記。

關鍵詞：雙孢蘑菇；栽培菌株；產(chǎn)量；質量；分子標記

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.001

Abstract： In this paper， a large scale of SRAP， ISSR and RAPD analyses on DNAs from 206 cultivated strains of Agaricus bisporus collected from around the word were carried out. 15 specific SRAP bands， 3 specific ISSR bands and 2 specific RAPD bands were obtained. 131 strains with three different agronomic traits among 206 strains were analyzed using the above 20 specific bands to study relation between markers and traits. The results showed that there were five markers closely related to quality traits， includingSRAP151000，SRAP23200，SRAP59650，SRAP510400andISSR8092100and three markers closely related to yield traits， includingSRAP23400，SRAP241200andSRAP231800. All the above related markers should be further validated and expected to become the specific molecular markers for screening and predicting of high yield and high quality strains in cross breeding of Agaricus bisporus.

Key words： Agaricus bisporus； cultivated strains； yield； quality； molecular markers

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費量最大的食用菌，具有重要的經(jīng)濟價值。我國主栽的商業(yè)菌株As2796為福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所自主研發(fā)的品種，從選育至今已使用20年，品種更新?lián)Q代亟須解決。產(chǎn)量、質量性狀是食用菌品種的一個重要的性狀，通過雜交育種將優(yōu)良的產(chǎn)、質量性狀整合在一起以實現(xiàn)農(nóng)藝性狀的提升是育種工作者常用的育種方法。但常規(guī)雜交育種對目的菌株的篩選存在盲目性強、工作量巨大等問題，嚴重影響了育種篩選的進程，急需定向的遺傳篩選手段。近年來發(fā)展的DNA分子標記輔助育種技術是食用菌定向育種的一個重要方向。目前，與雙孢蘑菇產(chǎn)、質量性狀相關的分子標記上，尚無文獻報道，所以非常有必要開展這方面的研究。本研究旨在探討雙孢蘑菇產(chǎn)質量緊密相關的分子標記，為縮短育種周期，簡化育種工作量，實現(xiàn)定向育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 試驗收集自世界各地206個雙孢蘑菇栽培菌株[1]，由福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所保藏并提供。

1.1.2 試劑與儀器 PCR試劑盒及其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。試驗SRAP上下游引物[2]、ISSR引物[3]、72條RAPD隨機引物及序列[1]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。試驗儀器：電泳設備采用Pharmacia Biotech EPS 600，拍照設備采用BIOV 藍盾 TM621。

1.2 方法

1.2.1 菌絲的培養(yǎng) 菌種接入常規(guī)PDA斜面培養(yǎng)基，24℃培養(yǎng)21 d。PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

1.2.2 總DNA的提取 基因組DNA提取采用真菌小量DNA提取法，提取方法參照文獻＼[2＼]操作。

1.2.3 PCR反應 SRAP、ISSR和RAPD 3種標記的PCR反應體系各組分及含量參照文獻＼[3＼]，擴增條件如表1所示。

電泳檢測：擴增產(chǎn)物20 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。GeneFinder熒光染料染色并拍照。

2 結果與分析

2.1 雙孢蘑菇栽培菌株的SRAP指紋圖譜分析

先用不同類型的少數(shù)菌株進行SRAP引物對的篩選，選出能產(chǎn)生較佳帶型和具有較好重復性的引物對：me1em2， me1em5， me2em3， me2em4， me5em9，me5em10。進一步用篩選出的引物對進行雙孢蘑菇206個栽培菌株總DNA的SRAP分析，共獲得了15條多態(tài)性特異條帶，部分擴增結果及特異條帶如圖1所示。

2.2 雙孢蘑菇栽培菌株的ISSR指紋圖譜分析

在雙孢蘑菇的ISSR引物初篩中發(fā)現(xiàn)，在52℃退火條件下，71個ISSR引物只有19個能產(chǎn)生可鑒別的穩(wěn)定帶型，其余均產(chǎn)生彌散狀不可鑒別帶型。這19個ISSR引物為807、808、809、810、811、822、825、827、834、835、841、842、852、853、854、855、857、866、868。利用這19個引物對上述10個SRAP標記條帶未能區(qū)分的傳統(tǒng)優(yōu)質菌株72個和傳統(tǒng)高產(chǎn)菌株24個作ISSR分析，獲得了3條多態(tài)性特異條帶，部分擴增結果及特異條帶如圖2所示。

2.3 雙孢蘑菇栽培菌株的RAPD指紋圖譜分析

以少數(shù)菌株進行RAPD擴增，對72個RAPD隨機引物進行初篩，發(fā)現(xiàn)26個引物有較佳帶型。進一步用26個隨機引物對上述ISSR分析中的傳統(tǒng)優(yōu)質菌株72個和傳統(tǒng)貼生菌株24個作RAPD分析，在找到新的標記后，再進一步對206個栽培菌株作RAPD分析。在26個引物中共發(fā)現(xiàn)2個引物（S258，S402）能穩(wěn)定體現(xiàn)群內差異，擴增結果獲得了2條多態(tài)性特異條帶，部分的擴增結果及特異條帶如圖3所示。

2.4 雙孢蘑菇栽培菌株DNA標記條帶統(tǒng)計

以上述15條SRAP、3條ISSR和2條RAPD標記條帶對206個雙孢蘑菇栽培菌株相對應的DNA圖譜進行分析和統(tǒng)計。15條SRAP、3條ISSR和2條RAPD標記條帶名稱及代號列于表2。相同引物PCR擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的標記條帶被認為屬于同一條帶，擴增陽性記錄為“1”，擴增陰性記錄為“0”，將圖形資料轉換成“0-1”數(shù)據(jù)資料，用于軟件分析。

2.5 雙孢蘑菇產(chǎn)、質量相關的分子標記統(tǒng)計分析

結合菌株的農(nóng)藝學性狀和酯酶同工酶表型，從上述206個菌株中選取具有代表性的131個菌株作為統(tǒng)計分析的樣本，這131個菌株中包括了49個傳統(tǒng)的優(yōu)質不高產(chǎn)菌株（同工酶表型G型）、49個傳統(tǒng)的高產(chǎn)不優(yōu)質菌株（同工酶表型H型）及33個優(yōu)質高產(chǎn)雜交菌株（同工酶表型HG4型，同As2796）。從表3可以看出，與雙孢蘑菇質量性狀明顯相關的標記有SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100；與雙孢蘑菇產(chǎn)量性狀明顯相關的標記有SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800。

從標記的相關程度上看，在質量性狀上，標記SRAP510400和ISSR8092100與雙孢蘑菇的質量性狀相關度較高。標記SRAP510400與質量性狀相關性達96%（47/49），與產(chǎn)量性狀相關性為0%（0/49）；標記ISSR8092100與質量性狀相關性達82%（40/49），與產(chǎn)量性狀相關性為4%（2/49）。

在產(chǎn)量性狀上，標記SRAP23400、SRAP241200和SRAP231800與雙孢蘑菇的產(chǎn)量性狀相關度很高。標記SRAP23400與產(chǎn)量性狀的相關性達86%（42/49），與產(chǎn)量性狀相關性為2%（1/49）；標記SRAP241200與產(chǎn)量性狀的相關性達98%（48/49），與質量性狀相關性為2%（1/49）； 標記SRAP231800與產(chǎn)量性狀的相關性達76%（37/49），與質量性狀相關性為0%（0/49）。

3 討論

在雙孢蘑菇性狀相關的分子標記的研究上，學者們在單孢可育性[4]、子實體顏色[5]、分解基質能力[6]、耐熱性[7]及叢生變異[8]等性狀上開展了研究并取得一些可用的標記。但在產(chǎn)量、質量性狀相關的分子標記研究上卻鮮有報道。本研究通過大規(guī)模的SRAP、ISSR、RAPD的擴增結合菌株的農(nóng)藝性狀的表型，探索可能存在的產(chǎn)、質量性狀和相關分子標記的關聯(lián)性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果表明：特定標記與雙孢蘑菇產(chǎn)、質量性狀具有明顯的關聯(lián)性。從標記在不同的3類菌株擴增的陽（陰）性的情況來看，同一個標記在傳統(tǒng)的（非雜交）優(yōu)質不高產(chǎn)菌株和高產(chǎn)優(yōu)質雜交菌株中的擴增陽（陰）性率存在差異，這個可能的原因是因為質量性狀屬于數(shù)量性狀，其表現(xiàn)為連續(xù)變異的性狀，決定性狀的表型是由為數(shù)眾多的微效基因所控制，而非單一的基因控制，且多個微效基因對性狀的貢獻度也會存在差異。對雜交菌株而言，由于遺傳物質的重組和重新分配，控制數(shù)量性狀的微效基因（或因子）在雜交子代中得到不同程度的繼承，導致子代出現(xiàn)性狀表型上的連續(xù)變異。由于本研究所采用的標記為共顯性標記，標記擴增結果的陽（陰）性與標記緊密相關的性狀的微效基因的有無相關。對于標記SRAP510400，在優(yōu)質不高產(chǎn)菌株的擴增陽性率為96%（47/49），而在高產(chǎn)優(yōu)質雜交菌株中的擴增陽性率為33%（11/33），同一標記在同一性狀的雜交菌株（高產(chǎn)優(yōu)質雜交菌株）與非雜交菌株（傳統(tǒng)優(yōu)質不高產(chǎn)菌株）間擴增陽性率的差異可能與雜交過程中的遺傳物質重組和重新分配，及該標記所緊密連鎖的微效基因對性狀的貢獻率有關。

本研究利用SRAP、ISSR、RAPD分子標記技術，并采用混合分離個體分析法，通過分組建立差異庫并擴大樣品數(shù)量的方法來消除本底差異的干擾。選擇了兩類具不同典型性狀的雙孢蘑菇品系作為分析差異的兩個DNA 庫，有效地降低了兩個DNA 庫的本底差異，為研究的可靠性提供了保證。本研究中獲得與雙孢蘑菇質量性狀明顯相關的 標 記 SRAP151000、SRAP23200、SRAP59650、SRAP510400、ISSR8092100及與雙孢蘑菇產(chǎn)量性狀明顯相關的標記SRAP23400、SRAP241200、SRAP231800，這些標記有望在雙孢蘑菇雜交育種中作為產(chǎn)質量性狀的輔助篩選標記。

參考文獻：

[1]郭仲杰.雙孢蘑菇栽培菌株的農(nóng)藝學性狀與DNA指紋分析[D].福州：福建農(nóng)林大學，2009.

[2]陳美元，廖劍華，李洪榮，等.雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（4）：149-156.

[3]陳美元，廖劍華，王波，等.中國野生蘑菇屬90個菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].食用菌學報，2009，16（1）：11-16.

[4]蔡志欣，陳美元，廖劍華，等.雙孢蘑菇不同交配型同核不育單孢的基因組文庫構建[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2017，32（12）：1327-1331.

[5]蔡志欣，陳美元，廖劍華，等.雙孢蘑菇顏色基因分子標記的初步篩選[J].食用菌學報，2014，21（3）：1-5.

[6]李洪榮，陳美元，廖劍華，等.雙孢蘑菇分解基質能力退化的同工酶分析[J].食用菌學報，2010，17（2）：52-55.

[7]陳美元.雙孢蘑菇耐熱相關基因0281的克隆與序列分析[J].福建輕紡，2006（9）：1-5.

[8]陳美元，王澤生，廖劍華，等.雙孢蘑菇叢生變異的RAPD分析及差異片段的克隆[J].廈門大學學報（自然科學版），2003（5）：657-660.

（責任編輯：林玲娜）