敲低circEPSTIl抑制人胃癌SGC—7901細胞生長與增殖

鄧崇文 陳艷輝 張志偉

[摘要]目的：探討環狀RNA circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細胞的生物學功能。方法：運用MTT實驗檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細胞的生長能力；AnnexinV-FITC/PI檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細胞的凋亡作用。結果：MTT檢測發現，敲低circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901細胞的生長，具有時間依賴性；AnnexinV-FITC/PI實驗顯示，敲低circEPSTIl能顯著促進胃癌SGC-7901細胞的凋亡作用，差異有統計學意義（P<0.05），結論：敲低circEPSTIl可抑制人胃癌細胞生長，誘導胃癌細胞凋亡

[關鍵詞]circEPSTIl；胃癌；生長與凋亡

非編碼RNA的種類繁多，其中包括了具有調節功能的微小RNA（microRNAs， miRNAs）以及環狀RNA（ circular RNAs，circRNAs）等。miRNA是一類廣泛存在于真核牛物中的長度約22nt的內源性單鏈非編碼RNA分子[1]。miRNA的主要作用機制是與靶基因的3' UTR形成不完全互補配對，阻斷靶基因翻譯從而達到基因調控的目的。或與靶基因形成完全互補配對，引起靶基因在互補區發牛斷裂，導致基因沉默[2]。circRNA是南外顯子和（或）內含子轉錄物構成的共價環狀閉合的單鏈RNA，其廣泛存在于各種細胞中，有著比線性RNA更為穩定的特性[3]。然而目前關于circEPSTIl在胃癌中的表達情況、牛物學功能以及參與胃癌發牛發展的作用機制仍不清楚。本研究采用MTT、細胞流式檢測分析circEPSTIl在人胃癌SGC-7901細胞中的牛物學行為，為進一步闡明胃癌發牛發展的分子機制提供實驗依據。

1 實驗方法

1.1 體外細胞培養常規培養。

1.2 MTT測定以每孔5000個細胞的密度接種在96孔板中，并在370C孵育24小時。然后將細胞再培養48小時，并且根據說明書進行MTT測定。使用Bio-Tek EPOCH2測量570nm的吸光度；

1.3 si-RNA轉染目的細胞完全培養基中細胞生長至約50%密度；計算配好lipofectamin2000及轉染；室溫下放置20 min，使DNA與脂質體形成復合體；用無血清培養液洗滌培養瓶中的細胞。往復合體中加入無血清的培養液（不含抗牛素），溫和混勻，加入到待轉染的培養瓶中；置于37。C，5%C02培養箱中，放置24-48 h后，收集細胞，進行實驗。

1.4 Annexin V/PI雙染色法細胞凋亡實驗 （1）用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×緩沖液；（2）細胞收集。用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細胞；（3）細胞洗滌：用預冷1×PBS（ 40C）重懸細胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細胞；（4）加入300卜L1的1×緩沖液懸浮細胞；（5）Annexin V-FITC標記：加入5μ1的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15分鐘；PI標記：上機前5分鐘再加入5μ1的PI染色；（6）補加200卜Ll的1×緩沖液；（7）流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI；（8）結果判讀：在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（ FITC-IPI-）；有上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（ FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-），

1.5 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，當P<0.05時，為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細胞生長的影響通過轉染circEPSTIl的siRNA及其對照過夜后，消化細胞，將人胃癌SGC-7901細胞以2×103個的密度接種于96孔板，每種細胞接種4孔，連續3天在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，記錄結果取均值并繪圖，實驗重復3次。結果表明，在轉染circEPSTIl siRNA 24h、48h、72h后OD值為（0.484±0.003）、（0.575±0.003）、（0.654±0.003）分別與對照組（0.563±0.037）、（0.759±0.028）、（0.955±0.031）比較，差異均有統計學意義（P<0.05），提示過表達circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901細胞的生長。

2.2 敲低circEPSTIl誘導胃癌細胞的凋亡為檢測敲低circEPSTIl對胃癌細胞的抑制效果，我們選用SGC-7901胃癌細胞，circEPSTIl處理48 h后，選用AnnexinV-FITC和PI染色來檢測凋亡細胞，結果顯示，circEPSTI1可以引起的細胞凋亡（21.67±1.49）%，而經sl-control處理的陰性對照組（7.50±0.87）%，無明顯的細胞凋亡發生。該結果說明敲低circEPSTIl可誘導胃癌細胞SGC-7901發生凋亡。

3 討論

近幾年隨著牛物信息學以及高通量測序技術的進步，環狀RNA的研究得到了前所未有的關注與發展。迄今為止，科學家們已經在各種生物體中發現了超過一萬種不同的環狀RNA。由于環狀RNA具有獨特的結構，細胞類型特異性和組織特異性表達模式，以及在血液，唾液和外泌體中穩定表達的特點，環狀RNA成為了當今癌癥研究中的熱點。關于clrcRNA在胃癌中的作用知之甚少，circRNA 000479來自EPST11基因，其位于染色體13q14上，因此我們將circRNA 000479命名為“circEPSTIl”。EPSTI1基因功能涉及廣泛的上皮一基質相互作用[2]，先天性免疫[2]，并且該基因的表達可能是癌癥侵襲和轉移中的關鍵事件[1]。攜帶EPSTI1和circEPSTIl的染色體13q14的異常常見于包括胃癌在內的多種癌癥[3-5]。本研究通過MTT以及細胞凋亡實驗證實敲低circEPSTIl能夠抑制胃癌細胞系的生長與增殖，并且促進凋亡。這些結果說明circEPSTIl能夠促進胃癌的惡性生物學行為，有可能成為潛在的治療靶點。

綜上所述，我們的研究表明環狀RNA在胃癌惡性生物學行為中發揮作用，可能通過作為miRNA海綿發揮調節功能。下一步通過體內體外的功能實驗，闡明circEPSTIl通過涉及競爭性內源RNA的機制影響胃癌的增殖和凋亡的分子機制。對環狀RNA的進一步研究和關注將有助于我們更好地了解胃癌的進展，并為胃癌的生物標志物或潛在治療靶點提供新的思路。

參考文獻

[l]Chen LL.The biogenesis and emerging roles of circular RNAs.Nature reviews Molecular cell biology.2016；17：205-11

[2]Sanger HL，Klotz qRiesner D.Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.Ptoceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.l976；73：3852-6

[3lSalzman J，Gawad C，Wang PL.Circular RNAs are the predominant transcript isofonn from hundreds of human genes in diverse cell types.PloS one.2012；7：e30733.

[4]Jeck WR，Sharpless NE.Detecting and characterizing circular RNAs.Nature biotechnology.2014；32：453-61.

[5]Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K.Circular RNAs are abundant，conserved，and associated with ALU repeats.Rna.2013；19：141-57