上海地區玉米品種DNA指紋圖譜采集及數據分析

姚丹青,樓堅鋒,顧芹芹,劉 建,張 琪,夏建明?

(1上海市種子管理總站,上海201103;2上海交通大學農業與生物學院,上海200240)

簡單序列重復(Simple sequence repeat,SSR)標記是建立在PCR(Polymerase chain reaction)反應基礎之上的一種遺傳標記,相比其他常用技術具有穩定性好、準確性高等優點,已經被廣泛運用于農作物品種鑒定中。辛景樹[1]從DNA快速提取、引物篩選等技術環節進行系統研究,建立了完整的SSR技術體系,制作了國內192個玉米主推品種及親本的DNA指紋圖譜,并開展了玉米種子純度與品種真實性鑒定的推廣應用。隨著社會經濟的發展,鮮食玉米如糯玉米、甜玉米等的遺傳改良及新品種選育工作得到高度重視,新品種不斷涌現,種子市場異常活躍。近年來,鮮食玉米遺傳育種及生產應用發展迅速,但分子標記技術在種質鑒定中的應用與普通玉米相比仍顯落后。本試驗利用DNA指紋圖譜技術,通過選用一系列鮮食玉米SSR引物,對上海地區的32個鮮食玉米品種進行指紋標記,以期為當地玉米種子市場的品種管理提供一種快速、有效的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用上海市2013年、2014年和2015年審定和生產上應用的鮮食玉米品種,共計32份(表1)。

表1 上海市鮮食玉米品種材料及來源Table 1 The materials and sources of 32 maize varieties in Shanghai

1.2 DNA提取和SSR引物篩選

所有試驗材料均采集幼苗或葉片,使用北京天根生化公司植物新型基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取,并在1.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳,檢測DNA質量,電泳緩沖液為1×TAE,電壓100 V;DNA純度和濃度利用NanoDrop2000c紫外可見光譜儀(Thermo公司)進行測定,稀釋至50 ng∕μL的工作液備用,4℃冰箱儲藏。

SSR引物來源于2個方面：參考國內外發表的文獻,選擇具有多態性的引物;自行設計,根據數據庫提供的SSR位點序列,利用引物設計軟件PRIMER 5.0設計。初步確定40對引物用于初篩分析。所有引物由上海生工有限公司合成。

PCR 反應體系：HotStart Mix 2 × 10 μL,Coralload 10 × 2 μL,上下游引物各 0.6 μL,50 ng∕μL 模板1 μL,ddH2O 5.8 μL,總體積為20 μL。 PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性40 s,55—60℃退火35 s,72℃延伸45 s,36個循環;72℃延伸10 min,擴增產物4℃保存。

1.3 DNA指紋圖譜的采集及數據分析

所有數據分析基于QIAxcel ScreenGel 1.4版軟件,通過軟件系統自動對指紋的原始數據進行分析,確定每個位點的等位基因。采用NTSYS-pcv 2.11軟件進行聚類分析,構建分子系統樹。

2 結果與分析

2.1 引物初篩

取表型差異較大的20個玉米品種作為引物初篩材料,對擴增產物進行電泳分析,根據電泳譜帶分析結果(圖1),篩選出具有一定多態性、擴增容易、擴增帶型清晰且穩定的引物進行復篩。

2.2 引物復篩

以收集的所有玉米品種為材料,采用毛細管電泳系統對擴增產物進行檢測分析。一是分析產物的峰型,淘汰一些連續多峰且主峰不穩定、高低峰不明、雜峰多等不容易分析的引物,保留較好峰形的引物(圖2);二是統計每個位點等位基因數,并根據等位基因的頻率計算位點的多態性信息含量(PIC),保留PIC大于0.5的引物;三是考慮引物染色體均勻分布,確保每條染色體上有1個位點。品種鑒定引物組合須滿足3個要求：鑒別能力強(滿足海量品種的鑒別),數量適宜(經濟方便),染色體分布均勻(不連鎖)。按照候選引物的PIC值以及所在的染色體進行排序,取每個染色體上PIC最高的引物作為組合基數,通過遺傳聚類分析組合的鑒別能力,將收集的品種進行有效區分,最終確定適合玉米品種鑒定的候選引物25對(表2)。

圖1 利用毛細管電泳系統檢測引物多態性Fig.1 Detection of primer polymorphism by capillary electrophoresis

圖2 復篩引物P15的峰型和等位基因分析Fig.2 Peak type and allele analysis of rescreened primer P15

表2 適合玉米品種鑒定的候選引物的確定Table 2 Determination of candidate primers suitable for identification of maize varieties

2.3 DNA數字指紋建立

以多態性高、重復性好、帶型易區分統計的原則[2],確定了25對核心引物,將SSR-PCR擴增產物特征譜帶進行0、1數字化,建立數據庫。

表3 上海地區32個玉米品種DNA指紋數據Table 3 DNA fingerprintdata of 32 maize varieties in Shanghai

2.4 遺傳多樣性分析

圖3 32個玉米品種25對引物組合的遺傳聚類圖Fig.3 Clustering map of 25 markers on 32 maize varieties

根據25對SSR引物的擴增結果進行遺傳多樣性分析,32個玉米品種的相似系數為0.460—0.900,在遺傳相似系數為0.53時,可將32個玉米品種分為三大類群(圖3)。其中,8(‘萬彩糯3號’)、12(‘蘇珍花糯2012’)、19(‘蘇科糯3號’)、21(‘蘇珍甜糯5 號’)、22(‘滬五彩花甜糯’)聚類到第2 類群,籽粒顏色都為花色相間。在遺傳相似系數為0.64時,可將第2聚類群分為3組,第2組中的25(‘滬甜1301’)、26(‘先甜5 號’)、27(‘圣甜1 號’)、28(‘先甜90’)、29(‘滬甜1 號’)、32(‘金珠甜脆’)均為黃色籽粒、穗軸白色、花絲綠色;第3組中的10(‘申科糯1號’)、16(‘華耘黑糯501’)、15(‘天糯一號’)、20(‘荊恒一號’)、21(‘蘇珍甜糯5號’)均為糯玉米。

3 討論

主要農作物品種審定登記制度實施以來,審定品種的數量呈逐年增多趨勢,截至2013年底,玉米審定品種數量達到6 291個[3],給品種高效管理帶來了挑戰;隨著玉米品種資源遺傳基礎日趨狹窄及少數骨干親本被集中應用,出現了一批在原品種基礎上僅做細微改良的派生品種,對品種鑒定技術提出了更高的要求;市場上出現標簽名稱與實際包裝的種子不符等品種真實性問題,增加了種子市場監管的難度[4]。目前,SSR標記技術在玉米、水稻等農作物中已有廣泛運用。李新海等[5]利用SSR標記研究了21個玉米自交系的遺傳變異。劉杰等[6]采用SSR標記和雜種優勢聚類方法分析了中國15個玉米自交系的遺傳變異,初步對雜種優勢類群進行劃分;劉世建等[7]對四川地方玉米種質資源進行SSR聚類分析,研究了28個玉米自交系的遺傳變異。喬志軍等[8]對180份玉米自交系親緣關系進行了分子評價。傳統育種多由表現型間接對基因型進行選擇和分類,存在很大的隨機性和盲目性。分子標記技術的發展為評價玉米種質資源基礎及雜種優勢利用提供了新技術和手段,同時也為構建玉米品種指紋數據庫提供了良好的基礎。本研究選定2013年、2014年和2015年上海審定和生產應用的主要鮮食玉米品種,基于標準化的建庫程序和毛細管電泳檢測平臺的運用,利用SSR標記技術進行指紋圖譜采集,經過對引物初篩,最終選用了25對玉米SSR引物對32個玉米品種進行了指紋數據分析,并構建了DNA指紋圖譜數據庫,為當地玉米品種、真實性鑒定奠定了快速檢測的基礎,為政府的品種管理、企業的品種維權、農民的利益維護提供強有力的技術支撐,有利于保護新品種知識產權和生產者利益,促進鮮食玉米研究及種子市場的健康發展。