擬南芥ABI3基因缺失突變體的鑒定及對鹽脅迫的響應

趙彥敏,高海琴,甕巧云

(1張家口廣播電視大學,張家口075000;2河北北方學院農林科技學院,張家口075000)

植物在生長發育過程中,不可避免地會受到各種非生物因素如干旱、低溫、高鹽及高溫等的脅迫,導致農作物的生長品質及產量下降。作為植物體內重要的逆境響應激素之一,脫落酸(Abscisic acid,ABA)既是脅迫的誘導產物,又是脅迫信號的傳導者,通過級聯放大反應,能迅速參與到植物抗脅迫的反應中。此外,脫落酸還參與植物生長的其他環節,如能促使馬鈴薯形成塊莖、抑制種子的萌發等。早期通過正向遺傳學方法篩選到一些在萌發率上對 ABA不敏感的擬南芥基因,如ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作為ABA信號的正調控轉錄因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐鹽性功能中起重要的作用[5],主要在種子里表達[2]。盡管在玉米、擬南芥、水稻等多種植物中已經發現了ABI3基因的存在,但ABI3在ABA介導的信號通路中的作用并不清楚。為了研究ABI3基因在擬南芥抗NaCl脅迫中的作用,本試驗檢測野生型擬南芥和ABI3基因突變體在NaCl脅迫下種子萌發率、籽苗根長及其生物量的差異,以期為研究擬南芥ABI3基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0和ABI3基因T-DNA插入突變體abi3種子購買于美國擬南芥種質資源中心(TheArabidopsisBiological Resource Center,ABRC),MS培養基干粉購于北京石木易生公司,植物DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒等購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 擬南芥的培養

分別取擬南芥野生型(Col-0)及ABI3基因突變體(abi3)種子,在10%NaClO3中消毒5 min后,用滅菌的去離子水沖洗2遍,播種于固體MS培養基上。在4℃下春化3 d,轉移至光照培養箱再培養7 d,分別將野生型Col-0和abi3突變體的籽苗移植于蛭石與石英砂混勻(1∶1)的花盆中,于光照培養箱中繼續培養2周。光照培養箱的培養條件為22℃、相對濕度60%、光周期8 h光照∕16 h黑暗、光照強度3 000 lx。

1.3 純合突變體abi3的篩選和鑒定

收集上述種植的擬南芥葉片,利用植物基因組DNA提取試劑盒提取擬南芥基因組DNA。以基因組DNA為模板,利用三引物法篩選和鑒定abi3純合突變體。根據http：∕∕signal.salk.edu∕網站上提供的TDNA 插入位點信息,設計鑒定引物。 引物分別為 LBb1.3：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’、LP：5’-TCGGTCCATGGTAGGTAACTG-3’和 RP：5’-GAGAAGATCCGACTCCAAACC-3’。 LP∕RP 和 LBb1.3∕RP 的PCR產物預期大小分別為1 220 bp和559—859 bp。25 μL PCR反應體系包括：1 μL DNA模板、上述3個引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,用ddH2O補足至25 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min;94℃變性40 s、60℃退火2 min、72℃延伸1 min,循環35次;最后72℃延伸10 min。

1.4 野生型Col-0和abi3突變體植株ABI3基因表達量測定

分別取上述擬南芥的葉片提取總RNA,并反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,以擬南芥β-actin為內參基因,檢測ABI3基因的表達情況。基因特異性正反引物分別為5’-TGAATCCGTACCAATATCCTTATG-3’和5’-TCTCGCCATCCGTTTCTTTC-3’;內參基因β-actin的特異性引物為5’-CTCCCGCTATGTATG TCGCC-3’和5’-CAGCAAGGTCAAGACGGAGG-3’。 PCR 反應體系：2 × dNTP mix 25 μL,正反引物(25 pmol∕μL)各1 μL,模板cDNA 2 μL,補水至50 μL。 擴增程序為：94℃ 預變性4 min;94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環35次;最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5 NaCl脅迫對擬南芥植株的影響

擬南芥野生型Col-0和abi3突變體種子經表面消毒后,分別播種于含有不同濃度NaCl(0 mmol∕L、100 mmol∕L、125 mmol∕L、150 mmol∕L)的 MS 培養基上。 觀察種子萌發情況,并于第 7 天統計各處理的萌芽率(以種子露白為準),于第9天測定各處理的生物量(30株∕處理)。為了檢測NaCl脅迫對突變體根長的影響,種子消毒后點種于培養皿進行垂直培養,培養8 d后進行根長的測量。

2 結果與分析

2.1 突變體鑒定

根據http：∕∕signal.salk.edu∕網站所提供的信息,可知T-DNA插入到該基因的第1個內含子內(圖1-A),由于T-DNA的片段較長,引物LP∕RP不能將其所包含的DNA序列擴增出來。如果是突變純合子,只能借助T-DNA上的引物與基因上的引物LBb1.3∕RP才能擴出條帶,條帶大小約為500 bp;如果是突變雜合子,利用LBb1.3∕RP和LP∕RP兩對引物在DNA水平上可擴增出2個條帶,分別約為500 bp和1 000 bp。由圖1-B可知,所檢測的突變體均為純合突變體。對初步鑒定出的純合突變體進行RT-PCR,如圖1-C所顯示,擬南芥野生型Col-0擴增出一條帶,約500 bp,7株突變體中只有第5株沒有擴增產物。由此可見,所檢測的7株突變體中只有1株中的ABI3基因因為T-DNA的插入而完全沉默。收集該植株的種子,用于后續ABI3基因功能的研究。

圖1 擬南芥abi3突變體的鑒定和基因表達分析Fig.1 Identification and gene expression analysis of Arabidopsis thaliana mutant abi3

由圖2可知,在無脅迫條件下,野生型Col-0及abi3突變體植株表型差異不明顯。

2.2 NaCl脅迫對abi3突變體的影響

2.2.1 NaCl脅迫對突變體種子萌發率的影響

由圖3可知,在不含NaCl的培養基上,擬南芥野生型Col-0和abi3突變體種子的萌發率并無顯著差異,且長勢基本一致;隨著NaCl濃度的升高,abi3突變體種子的萌發率明顯受到抑制,當NaCl濃度達到150 mmol∕L時,abi3突變體種子的萌發率僅為44%,與野生型Col-0種子的萌發率存在極顯著差異。

圖2 野生型Col-0(左)和abi3突變體(右)的表型Fig.2 Phenotypes of wild type Col-0(left)and abi3 mutant(right)

圖3 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥種子的萌發率Fig.3 Germination rate of Arabidopsis thaliana seeds under NaCl stress of different concentrations

2.2.2 NaCl脅迫對突變體生物量的影響

圖4 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥的生物量Fig.4 Biomass of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations

如圖4所示,在不含NaCl的培養基上,擬南芥野生型Col-0的生物量高于abi3突變體,但二者之間的差異并不顯著;隨著NaCl濃度的升高,野生型Col-0與abi3突變體的生物量均明顯下降,但突變體下降的幅度更為顯著,當NaCl濃度達到125 mmol∕L和150 mmol∕L時,abi3突變體與野生型Col-0的生物量之間存在極顯著差異。

2.2.3 NaCl脅迫對突變體根長的影響

如圖5所示,野生型Col-0與abi3突變體的根長在不含NaCl的培養基上盡管有所不同,但二者之間的差異并不顯著;隨著NaCl濃度的升高,野生型Col-0與abi3突變體根長的生長均受到了抑制,突變體受抑制的程度更為顯著,當NaCl濃度達到125 mmol∕L和150 mmol∕L時,野生型Col-0與abi3突變體的根長之間存在極顯著差異。

圖5 不同濃度NaCl脅迫下擬南芥植株的根長Fig.5 Root length of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations

3 討論

ABA是保衛細胞信號轉導的關鍵信號因子,不僅參與生物脅迫,而且在低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫條件下也起著重要作用。普遍認為ABA通過促進開放的氣孔關閉或抑制關閉的氣孔開放,控制植物與外界進行水分與氣體的交換,從而調節植物的代謝與生理活動[6]。如給番茄噴施外源ABA時,miR159的表達量會下調,從而上調其對應的靶基因MYB[7],而MYB基因的上調對提高植物抗逆境能力有促進作用[8]。種子休眠的建立和維持與ABA有著密切的相關性,ABA的累積可誘導野生型擬南芥種子進入休眠,并維持休眠狀態,而ABA不敏感突變體(abi1和abi2)種子表現為輕度休眠[9-10]。本研究中,當野生型Col-0與abi3突變體受到150 mmol∕LNaCl脅迫時,abi3突變體種子的萌發率、籽苗的生物量以及根長的受抑制程度顯著高于野生型Col-0,初步表明ABI3基因在擬南芥抗NaCl脅迫中起著極其重要的作用。