高壓氧對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦皮質線粒體生物合成的影響

荊翠翠，張 英，周 茉，劉媛媛，張紅英

中樞神經系統高度依賴線粒體氧化磷酸化產能，因而線粒體成為腦組織缺血缺氧主要受累細胞器。研究表明，缺血缺氧導致線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中電子漏增加，大量氧自由基產生超過了抗氧化酶清除能力，導致線粒體功能受損[3]。張小燕等[4]證明，高壓氧可改善新生大鼠缺血缺氧后腦皮質細胞線粒體膜電位。值得注意的是，細胞能量水平由線粒體質量和數量共同決定，后者受到線粒體生物合成(mitochondrial biogenesis)的調控，是線粒體質量控制的關鍵環節[5]。本研究擬觀察高壓氧是否可通過改善線粒體生物合成提高新生大鼠大腦皮質對缺氧缺血的抵抗力，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生7日齡健康雄性Wistar大鼠48只，體重11～18 g，由北京維通利華實驗動物技術公司提供。隨機分為三組，假手術組(Sham)，HIBD模型組(HIBD)和高壓氧治療HIBD組(HBO+HIBD)，每組16只。

1.2 HIBD模型制備 HIBD和HBO+HIBD兩組動物參照文獻制備HIBD模型。大鼠乙醚麻醉，仰臥位固定，頸部正中線切開，游離左側頸總動脈，雙線結扎后在中間剪斷，關閉切口。術后1 h將大鼠放入37 ℃恒溫缺氧密閉箱，箱內持續通氮氧混合氣體(92% 氮氣和8%氧氣)。缺氧2 h后取出，由母鼠喂養，直至21日齡。Sham組大鼠不結扎和剪斷左側頸總動脈，其余操作同HIBD模型。

1.3 高壓氧治療 HBO+HIBD組動物在HIBD建模后30 min放入高壓氧艙(氧濃度85%～90%，壓力為2個標準大氣壓)內吸氧90 min。每隔24 h入艙治療一次，連續治療7次。HBO治療后24 h，每組動物隨機抽取8只，斷頭處死，冰面上快速分離雙側腦皮質，凍存于-80 ℃用于Western檢測。剩余大鼠繼續飼養至40日齡，進行Morris水迷宮檢測。

1.4 Morris水迷宮行為學檢測 水迷宮的圓形水池分為東、西、南、北四個象限。加入牛奶使池水渾濁，透明平臺放置于水面下2 cm。實驗全程水溫恒定為23 ℃，水池周邊物體位置保持不變。(1)定位航行試驗，共5 d，每日分為上午和下午兩個訓練時間段，每個時間段4輪次，分別從4個象限的中點面壁入水，如大鼠在60 s內找到并爬上平臺，則將時間記錄為其逃避潛伏期，如大鼠在60 s內未能找到平臺，其逃避潛伏期為60 s。每次訓練間隔60 s。(2)空間探索實驗，第6天撤除水池中平臺，原平臺對側象限中心為大鼠入水點，觀察120 s內穿越原平臺所在位置的次數，定義為穿越平臺次數。所有大鼠入水點必須一致。

1.5 大腦皮質相關蛋白表達 Western blot法檢測，以β-tubulin為內參。大腦皮質組織勻漿與SDS上樣緩沖液混合加熱處理5 min，上樣后經SDS-PAGE電泳分離，濕轉法轉移至PVDF膜，對應一抗振蕩孵育12 h，PBS洗凈后用辣根過氧化物酶標記二抗靜置孵育1 h，PBS洗凈后用顯色試劑盒顯影，X-ray膠片曝光記錄。掃描條帶灰度值。Sham組條帶灰度值定義為100%，HIBD和HBO+HIBD組為與Sham組比較的相對表達量。

2 結 果

2.1 實驗動物數量分析 在HIBD模型制備期間，假手術組大鼠無死亡，HIBD模型組死亡3只，高壓氧治療HIBD組死亡2只。高壓氧治療期間大鼠無死亡。最終進行Western blot蛋白檢測的，三組大鼠均為8只。進行神經行為學檢測的，假手術組8只，HIBD模型組5只，高壓氧治療HIBD組6只。

2.2 高壓氧對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經行為學的影響 與Sham組比較，HIBD和HBO+HIBD組逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05)，HIBD組穿越平臺次數顯著減少(P<0.01)。HBO+HIBD與HIBD組比較，逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數顯著增多(P<0.01)。見表1。

比較項目Sham(n=8)HIBD(n=5)HBO+HIBD(n=6)定位航行實驗逃避潛伏期(s)15.31±2.4242.50±6.46②21.49±3.77①③空間探索實驗穿越平臺次數(次)8.64±1.065.26±0.78②7.41±1.13③

注：Sham代表假手術組，HIBD代表HIBD模型組，HBO+HIBD代表高壓氧治療HIBD組。與Sham組比較，①P<0.05, ②P<0.01；HBO+HIBD組與HIBD組比較，③P<0.01

2.3 高壓氧對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質線粒體生物合成相關蛋白表達的影響 與Sham組比較，HIBD和HBO+HIBD組COXⅣ和NRF1表達均顯著降低(P<0.05)，HIBD組PGC-1α和Tfam表達顯著降低(P<0.01)。HBO+HIBD與HIBD組比較，COXⅣ、Tfam、NRF1和PGC-1α表達均顯著升高(P<0.05)。見表2，圖1。

比較項目Sham(n=8)HIBD(n=8)HBO+HIBD(n=8)COXⅣ100.00±14.6662.83±11.02②82.15±14.84①③PGC-1α100.00±11.5167.26±10.40②112.19±18.41④Tfam100.00±12.2176.40±9.32②92.15±13.99③NRF1100.00±15.1449.28±7.14②72.29±12.88②④

注：Sham代表假手術組，HIBD代表HIBD模型組，HBO+HIBD代表高壓氧治療HIBD組。與Sham組比較，①P<0.05, ②P<0.01；與HIBD組比較，③P<0.05, ④P<0.01

圖1 各組大鼠大腦皮質COXⅣ、PGC-1α、Tfam和NRF1表達

注：Sham代表假手術組，HIBD代表HIBD模型組，HBO+HIBD代表高壓氧治療HIBD組。

3 討 論

線粒體生物合成是在細胞核DNA和線粒體DNA兩個基因組協同調控下，形成新生線粒體的過程。細胞應對內、外環境改變時，通過線粒體生物合成調控線粒體數量，從而實現能量代謝持續性重構，提高細胞適應能力。此外，應激導致線粒體損傷，線粒體生物合成啟動以發揮修復和補充的功能[6]。本研究中，新生大鼠HIBD后，Morris水迷宮測試結果顯示，其空間學習記憶能力明顯障礙，同時腦皮質線粒體生物合成異常，表現為線粒體數量標志蛋白COXIV表達水平降低。Demarest等[7]在新生大鼠HIBD后腦皮質中發現，反映單個線粒體健康水平的線粒體膜電位顯著降低。結合本研究結果，提示缺血缺氧通過抑制線粒體生物合成降低線粒體修復和新生能力，進一步加重神經元能量供應障礙。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(PGC-1α)是調控線粒體生物合成的關鍵轉錄因子。PGC-1因可通過促進核呼吸因子NRF1表達啟動細胞核DNA編碼的線粒體組件蛋白表達，亦可通過促進線粒體轉錄因子A(Tfam)表達啟動線粒體DNA編碼的線粒體組件蛋白表達[8]。本研究中，新生大鼠HIBD后腦皮質PGC-1α、NRF1和Tfam表達均明顯降低。Sosunov等[9]發現，缺血初期海馬組織PGC-1α代償性升高，而持續性缺血導致PGC-1α表達降低。研究表明，炎性反應因子主控基因NFκB可直接結合PGC-1α啟動子，抑制后者表達[10]。Gu等[11]發現，新生大鼠HIBD后腦皮質NFκB表達異常升高。以上提示，缺血缺氧誘導NFκB對PGC-1α的抑制可能是新生大鼠HIBD后腦皮質線粒體生物合成障礙的機制之一。

本研究發現，高壓氧顯著改善新生大鼠HIBD后空間學習記憶能力，同時部分恢復COXIV表達水平。Choi等[12]報道，線粒體營養素α-硫辛酸可提高大鼠腦缺血后空間學習記憶能力，同時增加腦皮質線粒體體密度。這提示上調線粒體生物合成是高壓氧提高新生大鼠腦皮質抵抗HIBD能力的途徑之一。 筆者還發現，高壓氧提高了HIBD后腦皮質PGC-1α及其下游NRF1和Tfam的表達水平。Susilo等[13]證明，高壓氧顯著抑制創傷深部骨骼肌NFκB表達及活性。這可能是高壓氧逆轉HIBD對PGC-1α表達抑制的通路之一。研究表明，PGC-1α不僅參與調控線粒體生物合成，還參與調控MnSOD、GPx等線粒體抗氧化酶的表達[14]。Zhu等[15]證明，高壓氧可明顯抑制HIBD后腦組織氧化應激水平。筆者推測，在高壓氧干預HIBD中，PGC-1α上調不僅與改善線粒體生物合成相關，還可能與提高神經元抗氧化能力相關。

總之，本研究證明高壓氧可通過上調PGC-1α-NRF1/Tfam通路上調腦皮質線粒體生物合成，這可能是高壓氧改善大鼠HIBD后空間學習記憶能力的神經保護機制之一。