不同收獲期白刺花種子活力及干熱脅迫對幼苗生長發育的影響

吳麗芳， 魏曉梅， 陸偉東， 李 通， 姚晴晴， 趙小麗

(1.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

白刺花(Sophoradavidii)為豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora)多年生落葉灌木，在我國主要分布于西北、華北、華東和西南地區，在云南昆明、玉溪、曲靖、紅河、楚雄、大理、麗江、迪慶等州(市)海拔850～2 500 m的地區廣泛分布。因其具有耐旱、耐貧瘠、根系強大、固氮能力強等特性，在喀斯特地區成為了水土保持的先鋒樹種。白刺花種皮具蠟質，內含膠質，不透水、不透氣，硬實率高達81.9%[1]，若不經特殊處理，種子萌發率極低，不能正確指示實際發芽能力。徐本美等研究得出白刺花硬實種子活力高于非硬實種子，因此認為硬實是種子高活力的一種表現[2]。種子活力是決定種子或種子批在發芽和出苗期間的活性水平和行為的綜合體現[3]，表現在發芽率、成活率、耐藏性、抗老化等方面[4]，其高低主要受遺傳因素和環境條件的影響[5]。國內外學者在農作物如水稻[6]、大豆[7]、玉米[8]、小麥[9]上關于種子活力的研究多有報道，而有關白刺花種子活力方面國內除了徐本美等[2]早期研究過以外，目前尚見相關報道。本研究采用連續6年收集的白刺花種子，利用氯化三苯四氮唑(TTC)法研究白刺花種子活力，為豐富白刺花種子的特性提供理論基礎。

高溫干旱嚴重制約植物的生長發育，我國目前約有1/3的土地面積位于干旱、半干旱地區[10]。云南干旱現象幾乎年年出現，只是出現的時段和影響程度不同。1997年至2006年對云南氣候研究認為，云南高溫干旱多出現于4—8月之間，如2005年5月云南省元陽縣極端氣溫高達43.2 ℃，打破了1969年巧家縣的42.7 ℃極端最高氣溫的歷史紀錄[11-13]。高溫干旱協同的發生比單一的干旱或高溫對植物生長和產量危害要大[14]。有研究報道，高溫干旱影響了植物的葉片結構[15]、生理變化[16]、保護酶系統的防護[17]、光合作用和呼吸作用[18]、蛋白質變化等[19]。目前，對白刺花逆境的研究多側重于干旱單因子的報道，而較少研究高溫和干旱雙因子脅迫對其生長發育的影響。通過研究不同采集年份的種子活力、發芽率及干熱脅迫對幼苗生長早期形態、光合系統及生理生化的變化，旨在為種質資源收集保存及干熱脅迫對幼苗的傷害提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于2010年10月、2011年10月、2012年10月、2013年10月、2014年10月和2015年10月，在曲靖師范學院校園里連續采集6年的白刺花種子，脫去外殼，剔除有蟲害、干癟的種子后，分選出比較大的種子保存于4 ℃低溫冰箱中備用。

1.2 不同采收期白刺花種子活力測定

采用TTC法測定種子活力[20]：分別將不同采收期的白刺花種子浸泡24 h，剝離種皮露出種胚后進行染色，恒溫箱中保溫2 h，統計具有活力種子的百分率。

種子活力=有活力的種子數/測定種子總數×100%。

1.3 不同處理方法對白刺花發芽率試驗

1.3.1 常規萌發處理 將白刺花種子用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養皿中，每皿50顆，共5次重復。

1.3.2 沸水浸種 用始溫80 ℃的水浸泡種子1 d，浸泡過程中用振蕩器振蕩(70 r/min)以利于氧的吸收，然后用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養皿中，每皿50顆，共5次重復。

1.3.3 濃硫酸處理 濃硫酸(比重1.84)浸泡種子30 min，處理完之后流水下沖洗3 min，再用10%次氯酸鈉溶液消毒 10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養皿中，每皿50顆，共5次重復。

1.3.4 劃破種皮 用解剖刀把種子劃個小口，再用10%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養皿中，每皿50顆，共5次重復。

1.3.5 種子培養 在25 ℃恒溫光照箱里暗培養，按照《國際種子發芽規程》第5天統計發芽勢，第10天統計發芽率。

發芽勢=5 d內發芽種子數/供試種子數×100%；

發芽率=10 d內發芽種子數/供試種子數×100%。

1.4 干熱脅迫下白刺花幼苗生長的生理生化的試驗設計

1.4.1 白刺花幼苗的培育 以2014年收集的較大種子為試材，刀片劃破種皮后，70%乙醇消毒2 min，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4～6次后接種于不填加任何激素的MS固體培養基(0.7%瓊脂，3%蔗糖)中，自然光照下培養45 d后，室溫下煉苗5 d栽植于黑色塑料花盆中(花盆介質珍珠巖 ∶腐葉土 ∶紅壤土=1 ∶1 ∶2)，每處理栽植6盆，每盆栽種3棵，栽植好后將花盆放入實驗室靠陽光直射的窗戶邊，當幼苗成活后轉至校園理學樓2樓樓頂，常規澆水，生長2個月后進行干熱脅迫處理。

1.4.2 試驗設計 干熱脅迫前5 d將植株澆足水，然后將其放入人工氣候箱進行脅迫，脅迫期間不再澆水，脅迫溫度設定為25 ℃(T1)、30 ℃(T2)、35 ℃(T3)，25 ℃下正常澆水為對照(CK)，光照度8 000 lx，光—暗周期14 h—8 h，分別在脅迫2、5、8 d，脅迫復水后5 d測定相關指標。

1.4.3 試驗測定指標及方法 葉片相對含水量：參照Chartzoulakis等的方法[21-22]，各處理分別任取5株植株上部的10張葉片，立即稱鮮質量(mf)，然后置于水中，黑暗4 ℃條件下浸泡24 h至飽和狀態，稱量飽和鮮質量(mt)，最后將葉片于80 ℃烘干，稱取干質量(md)。植物葉片相對含水量(RWC)計算公式如下：

RWC=(mf-md)/(mt-md)×100%。

葉綠素含量：參照李合生的方法[20]，每一處理任取5株植株上的葉片，蒸餾水沖洗干凈，稱取0.1 g葉片研碎，用80%丙酮低溫黑暗下浸泡至完全變白，提取過濾液，用紫外分光光度計于波長646、663、470 nm下測定葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的吸光度，計算Chla、Chlb、Car的含量和Chla/Chlb以及Chl/Car的含量比值。

丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸比色法測定，具體過程參照上海植物生理研究所主編的《現代植物生理學實驗指南》[23]。

可溶性糖含量參照李合生的蒽酮比色法[20]測定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性：參照李合生的氮藍四唑光還原法[20]測定。

1.5 試驗數據的統計

使用SPSS 13.0和Excel 2003進行試驗數據分析，以0.05作為差異的顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 不同采收期白刺花種子活力變化

TTC測定種子活力依據種子呼吸代謝過程中的脫氫酶與TTC反應生成紅色的三苯甲腙(TTF)，代謝物質越多，顏色越深，表明代謝強度越強。由圖1可以看出，2010年采收的白刺花種子活力最低，僅67.4%，2015年采收的種子活力最強，為76.6%，6年間種子活力下降僅9.2百分點。2010—2012年采收的種子活力緩慢上升，2014—2015年采收的種子活力上升較快。通過方差分析發現，各年間采收的種子活力沒有顯著差異。

2.2 不同采收期白刺花種子的發芽勢和發芽率

白刺花種子不透水、不透氣，種皮有蠟質，具強休眠特性，須經特殊處理才能體現白刺花種子的種用價值。圖2和圖3分別為白刺花的發芽勢和發芽率，發芽率的大小隨處理方法的不同差異較大。從圖3可以看出，劃破種皮能使發芽率提高至74.67%，而常規發芽方法其發芽率僅10%左右，在不同的處理中，發芽率的由高到低分別是劃破種皮>濃硫酸處理>沸水處理>常規萌發。不同年際間采收的種子，發芽率也有所差異，其中劃破種皮處理2010年采收的發芽率最高，相比而言，2015年采收的發芽率最低，這可能是由于白刺花種子在低溫儲藏過程中，部分有破除休眠的作用。種子發芽勢反映了種子出苗的整齊性及幼苗生長的質量問題，通過試驗觀察白刺花的種子發芽勢在前4 d內均不高，且在試驗過程中同時也觀察到，最先吸漲的種子不發芽，經過3～4 d直至更長時間的充分吸漲后，白刺花種子才能萌發，這一現象表現出了硬實種子萌發的特性。從圖2和圖3中可以看出白刺花種子的發芽勢和萌發率受不同的萌發處理影響比較大，與種子活力無關，且不同年份采收的種子除了劃破種皮處理外，其余處理沒有明顯差異。

2.3 干熱脅迫下白刺花葉片含水量的變化

葉片相對含水量反映了植物生長過程中生化代謝強弱。生長旺盛時期，植物體內的含水量高，休眠期或停止生長時，含水量低。表1所示的是高溫干旱脅迫下白刺花葉片含水量的變化。當脅迫處理2 d時，對照處理與25 ℃干旱處理差異不顯著，30 ℃及35 ℃的高溫干旱處理與對照相比差異顯著。從植株外形看，植株長勢良好，葉片沒有太大變化，這可能也證明了白刺花具有一定高溫和干旱的忍耐力。脅迫5 d，不同高溫干旱處理下，均有顯著性差異，與對照相比，葉片含水量分別下降了9.4%， 13.6%和19.1%。脅迫8 d，明顯看到葉片萎蔫，卷曲皺縮，甚至有部分葉片外周干枯，與對照相比，均具有顯著性差異，且含水量分別下降23.2%、32.3%和48.3%。幾種處理過的葉片復水后5 d含水量也具有顯著性差異，含水量與脅迫8 d相比有所升高，但與對照相比，仍未完全恢復，說明當高溫及干旱超過限度后，植物一經損傷恢復起來有一定困難。

表1 干熱脅迫下白刺花葉片含水量的變化

注：不同小寫字母表示在0.05水平時的差異顯著。下表同。

2.4 干熱脅迫下白刺花光合色素含量的變化

表2為干熱脅迫下白刺花葉綠素含量的變化，從表中可以看出脅迫2 d Chla、Chlb和Car的含量隨脅迫溫度的增加有上升趨勢，可能是由于短期干熱脅迫時，葉片含水量減少，而白刺花本身對干熱的適應能力加速了光和色素的合成，從而能補償植物光合作用。但Chl/Car反而下降，也就是說葉綠素a和葉綠素b合成的速率沒有胡蘿卜素合成的速率快。脅迫5 d，Chla、Chlb、Car含量和Chl/Car的變化沒有規律性，Chlb之間沒有差異，Car和Chl/Car之間差異顯著，很可能是植物在適應環境的變化中，體內自身代謝合成與呼吸消耗的補償和超補償能力紊亂所致。在干熱脅迫8 d后與脅迫5 d處理相比，各指標有所變化，除Chl/Car外均呈下降趨勢，Chla、Chlb之間差異顯著，Car的含量CK與T1有顯著差異，但T2和T3沒有差異，尤其高溫35 ℃時，下降速率更快，這可能是因為持續的干熱情況下，白刺花整個的色素合成系統受損。復水處理后，白刺花光合色素恢復不一，且各含量之間多沒有顯著差異。

表2 干熱脅迫下白刺花葉綠素含量的變化

2.5 干熱脅迫下白刺花MDA含量的變化

植物遭受逆境脅迫時，MDA會與細胞內的物質發生反應，造成細胞膜系統發生變化，因此MDA含量的變化是細胞質膜損傷的指標之一。從表3可以看出，隨著脅迫時間的延長和脅迫強度的增加，MDA的含量增加，當脅迫2 d時，25 ℃下MDA含量增加的不多，僅增加了16%，當脅迫5 d時，各處理間均有顯著差異，且與對照相比，MDA分別增加了79.17%、120.83%和191.67%，增幅較大；脅迫8 d時，與對照相比，MDA分別增加了150.00%、188.46%和219.23%，增幅較脅迫2 d和脅迫5 d大，說明在高溫干旱下，隨時間的延長，膜脂過氧化反應持續加重，植物細胞質膜受到不同程度的損害。復水過后，細胞MDA含量雖與脅迫5 d、脅迫8 d相比有所減緩，但與脅迫2 d相比仍偏高，說明白刺花對短期干熱脅迫有一定抵抗力，超過一定時間后，細胞質膜會受到損傷。

表3 干熱脅迫下白刺花丙二醛含量的變化

2.6 干熱脅迫下白刺花可溶性糖含量的變化

可溶性糖是植物參與滲透調節維持細胞膨壓的物質之一，是有機碳的主要儲存形式。從表4可以看出，干熱脅迫下，隨著脅迫時間和脅迫強度的遞增，可溶性糖含量也增加。在干熱脅迫2 d，各高溫處理下可溶性糖含量逐漸增加。脅迫5、8 d，可溶性糖含量明顯上升，與對照相比，處理5 d的T3和處理8 d的T3可溶性糖含量分別增長了120%和160%。

表4 干熱脅迫下白刺花可溶性糖含量的變化

2.7 干熱脅迫下白刺花SOD活性的變化

SOD是植物體內清除活性氧自由基的保護酶之一，它可以通過與過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)共同作用清除超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫來減少活性氧對細胞膜的傷害、減輕膜質過氧化和穩定膜的透性。在植物正常生長過程中，植物體細胞內活性氧的產生和清除系統處于相對穩定的平衡中，當植物受到逆境的脅迫時，活性氧會大量積累，植物保護酶的防御系統也相應地變化。如表5所示，隨著干旱和溫度的加劇，SOD活性呈上升趨勢，各處理間具有顯著差異，尤其當脅迫8 d時上升速度更快，復水后SOD值又開始下降。

表5 干熱脅迫下白刺花超氧化物歧化酶活性的變化

3 結論與討論

種子活力某種程度上代表了植物種胚的生長潛力，早期人們定義種子活力為種子在發芽和出苗期間的活性強度及特殊的綜合表現，認為高活力的種子發芽早，出苗整齊，對不良環境的適應能力強，它是種子質量好壞評價的重要指標之一。種子活力的高低受其本身的遺傳因素、貯藏環境和發芽環境條件影響。其中就遺傳方面，發育過程中貯藏物質的積累是種子活力形成的基礎，隨著種子的生長發育、成熟，體內蛋白質、淀粉的積累，種子活力逐漸提高。白刺花由于種皮不透水、不透氣，存在嚴重的硬實現象，若不經特殊處理，種子萌發率非常低。國際種子檢驗規程(ISTA 2005)[24]以及我國國家質量技術監督局發布的牧草種子國家標準(2001年)、林木種子國家標準(2000年)和農作物國家標準(1996年)[25]將硬實納入“未萌發種子”(ungerminated seeds)范疇。此類劃分對于硬實種子而言，制約了它的發育特性。早期人們研究就得出硬實種子的高活力特性具有普遍性，硬實程度的強弱與種子活力的高低呈正相關[26]。本研究中，種子采收越早，活力越低，可能是白刺花種子儲藏過程中有破除休眠的特性，致使代謝活性變化所致。但從6年的采收間隔而言，種子活力下降僅9.2百分點，年份間的變化沒有顯著差異，這充分證實了硬實種子高活力的特性。

不同處理方法對白刺花種子萌發率的影響有很大的差異，濃硫酸處理主要是利用強酸的腐蝕性作用使種皮充分吸漲，沸水處理也是促使種子的吸漲作用。在一些報道中，白刺花的種子萌發率最高的是砂紙摩擦處理，可以使發芽率達到70%以上[27-28]。砂紙摩擦與劃破種皮一樣，都是直接破除種皮吸水障礙，2種處理方法各有優劣，劃破種子不利于大規模的使用，砂紙摩擦容易損傷種子。規模化的生產中，建議采用沸水處理，簡單方便。

水是生命活動過程中不可缺少的，它參與了植物的代謝過程，一般來說植物組織含水量的多少與其生命活動強弱有平行關系，在一定范圍內組織的代謝強度與其含水量成正相關。本研究中隨著干熱脅迫時間的延長和脅迫溫度的增加，葉片相對含水量降低，而短時期的脅迫下，白刺花的光合色素含量反而升高，這可能是因為白刺花葉片含水量降低致使葉片縮小或卷曲而要提高光合作用的情況下所形成的一種補償作用。

MDA作為植物細胞膜不飽和脂肪酸發生過氧化作用的最終產物，含量高低反映細胞膜受傷害的程度，本研究中隨著脅迫強度的增加MDA的含量也遞增，尤其當脅迫8 d時上升最快。可溶性糖作為參與滲透調節維持細胞膨壓的重要物質，干熱脅迫下，植物體內的可溶性糖會大量積累，積累量越大，抗性越強。有研究認為，成熟白刺花葉片的抗氧化酶活性較高，其干旱適應性越強[29]。在植物的抗氧化系統功能所能容許限度內，干旱脅迫強度與抗氧化酶活性存在明顯的劑量效應。本研究中隨著干熱脅迫強度的加大，SOD活性也逐漸遞增，說明白刺花對干熱脅迫具有較強的耐受能力。