與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl連鎖的標記及應用

劉 蕾， 王 輝， 李文麗， 王 富

(青島農業大學園藝學院，山東青島 266109)

番茄頸腐根腐病(Fusariumcrown and root rot，簡稱FCRR)于1974年首次在日本被發現[1]，之后于1976年在美國南部被發現[2]。目前此病害已對美國、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韓國以及歐洲等許多國家和地區的番茄生產造成重大損失[3-7]。最近幾年，該病在我國華北、東北地區發病較重，其中山東省最早于2010年在壽光市發現該病，隨后逐漸蔓延至全省各地。當前，此病害已經嚴重威脅到山東省溫室大棚冬春季番茄生產[8]。

引發番茄頸腐根腐病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐專化型(Fusariumoxysporumf. sp.radicis-lycopersici，簡稱FORL)，此病侵染周期相對較長，番茄一旦感染，目前還沒有十分安全有效的治療方法[9]，所以對于該病害最科學的防治方法就是選育抗番茄頸腐根腐病的新品種。已有研究結果表明，番茄頸腐根腐病抗病性遺傳是由顯性單基因Frl控制的[10]，并且3份抗源材料中的抗病基因均為同一種基因[11]，3份番茄頸腐根腐病抗源材料都是源自野生番茄Solanumperuvianum(PI126944、PI128650和PI126926)，已有研究者將其中的抗病基因轉入栽培番茄中[12]，抗病基因Frl已被定位到9號染色體上[10，13]。

本研究利用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl連鎖的分子標記SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中進行驗證[14-15]，進而在F1代抗病材料自交后代群體中進行分子標記輔助篩選，結合接種鑒定結果評價該標記的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗材料包括已知抗病材料P1、感病材料P2及其雜交1代，抗病F1代商品品種凱文及F2代群體材料共24株(分別編號為1～24)。

1.2 方法

1.2.1 番茄樣品DNA的提取純化及檢測 采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)法提取試驗材料的DNA并進行純化，設計出合適的引物對番茄材料DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳及成像技術顯示DNA條帶并觀察分析。

1.2.2 引物合成 與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的共顯性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence，即酶切擴增多態性序列)標記C2-25由Staniaszek等設計[14]，SCAR200由Mutlu等設計[15]。引物序列交給生工生物工程(上海)股份有限公司協助合成。

1.2.3 PCR擴增反應 PCR反應體系：模板DNA(20～80 ng/μL)4.0 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 μL，引物F/R(10 μmol/L)各1.0 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)2.5 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s(SCAR200)或57 ℃退火40 s(C2-25)，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR擴增產物約 10 μL，在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR擴增結果，用自動凝膠成像系統觀察照相，記錄電泳結果。

1.2.4 酶切方法 使用限制性內切酶XapⅠ在37 ℃下將擴增產物酶切3 h，酶切反應體系：PCR產物5.0 μL、Buffer 1.5 μL、XapⅠ 0.3 μL，加ddH2O補足至15 μL。37 ℃酶切 2 h，取酶切產物5 μL經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用自動凝膠成像系統觀察照相，記錄結果。

1.2.5 番茄抗病材料的接種鑒定 將病原菌進行搖菌培養，25 ℃、150 r/min振蕩5 d，用3層紗布過濾除去菌絲并離心收集沉淀，將沉淀稀釋成107個/mL，將生長至1張真葉期的番茄根洗凈并將主根剪出傷口，浸泡在孢子懸浮液中15 min，并設置感病材料作為對照，置于18 ℃光照培養箱中培養，2周后觀察發病癥狀。

2 結果與分析

2.1 SCAR200和C2-25在P1、P2、F1代及凱文中的驗證

選用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標記SCAR200和C2-25，分別在抗病材料P1、感病材料P2、F1代及商品種凱文中進行PCR檢測。由圖1、圖2可知，SCAR200在抗病材料P1中可擴增出290 bp左右的特異DNA條帶，在感病材料 P2中可擴增出310 bp的目的條帶， 在F1代和凱文中均可擴增出290、310 bp 2條特征譜帶，可見SCAR200為共顯性標記，可用于已知抗、感材料的分子標記輔助鑒定。

CAPS標記C2-25在抗病材料P1中的酶切產物存在700 bp 左右的特異DNA條帶， 在感病材料P2中的酶切產物存在1 000 bp的目的條帶，在F1代和凱文中均同時存在700、1 000 bp 2條特征譜帶，可見該標記可以用于已知抗、感材料的分子標記輔助鑒定。

2.2 SCAR200和C2-25在凱文F2代群體單株中的檢測

對與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標記SCAR200和C2-25分別在凱文F2代群體中進行分子檢測，由圖3、圖4可知，F2代群體24個單株中有7個單株(編號分別為1、13、15、17、19、20、21)在SCAR200和C2-25檢測中為純合抗病單株；有5個單株(編號分別為5、10、12、16、22)為感病單株；其余12個單株(編號分別為2、3、4、6、7、8、9、11、14、18、23、24)為雜合抗病單株。

2.3 凱文F2代群體抗病接種鑒定結果

對24份未知抗病性的番茄單株進行人工接種頸腐根腐病病原菌鑒定，由表1可知，6個單株(編號分別為5、10、12、16、22、24)表現為感病，主根和莖基部都出現萎縮變褐現象，并且株高較小，根的長度也明顯短于未發病植株；其他植株根和莖基部均表現正常，表現為抗病。

圖3、圖4的分子標記檢測結果顯示，有5個單株(編號分別為5、10、12、16、22)為感病單株，與接種鑒定結果相比，僅有1個單株(編號為24)在分子鑒定過程中顯示為抗病，而在接種鑒定結果中顯示為感病，可見分子標記鑒定結果的準確率為95.83%。

3 結論與討論

近年來有研究表明，分子標記SCAR200在純合抗番茄頸腐根腐病材料中存在290 bp的特異譜帶，在感病材料中存在310 bp的特異譜帶，在雜合抗病材料中存在290、310 bp的條帶；CAPS標記C2-25在純合抗番茄頸腐根腐病材料中存在700 bp的特異譜帶，在感病材料中存在1 000 bp的特異譜帶，在雜合抗病材料中存在700、1 000 bp的條帶[14-15]。

表1 凱文F2代群體抗病接種鑒定結果

注：R、S分別表示抗病、感病。

本研究利用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標記SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中進行驗證，進而結合接種鑒定方法在抗病商品種凱文F2代群體中加以應用。結果顯示，SCAR200和C2-25均為共顯性標記，可以用于已知抗病和感病材料中的分子標記輔助鑒定；SCAR200和C2-25在凱文F2代群體24個單株中均檢測到7個純合抗病單株、5個感病單株和12個雜合抗病單株；接種鑒定結果顯示，有1個單株與分子鑒定結果存在出入，即分子標記輔助鑒定的準確率為95.83%。

本試驗中有1個單株接種鑒定結果表現為感病，而分子標記檢測結果為抗病，這種差異可能與2個分子標記與抗病基因Frl間尚存在一定的連鎖距離有關，因此后續研究可開發與抗病基因Frl連鎖關系更近乃至基因特異標記，從而提高分子標記鑒定的準確度。