豬圓環病毒Ⅱ型鹽城株的全基因組克隆與序列分析

陶宏衛， 郭廣富， 曹軍平， 申建榮， 張晉川， 練國俊， 朱愛萍， 張佳浩， 朱金其

(1.江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，江蘇泰州 225300； 2.江蘇泰州泰牧動物醫院，江蘇泰州 225300；3.江蘇濱海鴻盛生豬飼養有限公司，江蘇濱海 224500)

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)為圓環病毒科(Circoviridae)、圓環病毒屬(Circovims)，是迄今為止發現的最小的動物病毒之一。根據致病性、抗原性以及核酸序列的不同，將PCV分為PCV1和PCV2這2個血清型。PCV2感染豬群能引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合癥(porcine respiratory disease complex，PRDC)及懷孕母豬繁殖障礙(sow abortion and mortality syndrome，SAMS)等[1]。血清學和病原學調查證實，PCV2呈世界性分布，給養豬業造成巨大的經濟損失[2-3]。PCV2基因組大小約1.7 kp，包括5個基因亞型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e[4]。

本研究通過鹽城地區疑似發生PMWS的2個養豬場采集病料，PCR擴增PCV2全基因組，并進行序列測定和比較分析，旨在了解PCV2的遺傳變異情況，為今后的深入研究和科學防控該病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥豬的腹股溝淋巴結、脾臟和肺臟等組織，于2015年11月采自鹽城地區2個養豬場的2份病料。基因組DNA快速抽提試劑盒(動物)、TaqDNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、2 000 bp DNA Ladder、pUCm-T載體及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產品，6×DNA凝膠載入染料(Loading Dye)、內切酶PstⅠ等購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 引物的設計與合成

根據文獻[5]，合成1對可擴增PCV2全基因組的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：P1：5′-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3′；P2：5′-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。

1.3 病料中PCV2全基因組的PCR擴增

將采集的病豬脾臟、淋巴結和肺等組織混合，研磨研碎，按1 ∶5加入無菌含雙抗的PBS溶液，混勻，-20 ℃反復凍融3次，4 ℃ 8 000 r/min離心7 min，取上清，用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用 50 μL 反應體系：5 μL 10×buffer、TaqDNA聚合酶1 μL、模板DNA 3 μL、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 pmol/L 的上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸2 min，進行35個循環；最后72 ℃延伸 10 min。反應結束后用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結果并回收膠。

1.4 PCV2全基因組測序

將膠回收的PCR產物連接到pUCm-T載體上，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取經PCR初步鑒定為陽性的白斑菌，擴大培養后提取質粒，進行重組質粒的PCR鑒定和酶切鑒定，篩選出陽性克隆。將鑒定為陽性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 PCV2基因序列的比較分析

應用DNA Star和MEGA 5.2分析軟件對擴增的PCV2全基因組和GenBank中的8株PCV2基因序列進行遺傳進化分析。用于本研究分析的參考毒株基因組序列均來自于NCBI(表1)。

表1 各分離株信息

2 結果與分析

2.1 病料中PCV2全基因組的PCR擴增

以組織病料提取的DNA為模板，用P1和P2引物擴增PCV2全基因組，由圖1可知，2份病料均呈陽性，其PCR擴增片段大小約1.7 kb，與預期的結果相符。將2個豬場檢測到的PCV2分別命名為BH07株、BH11株。

2.2 重組質粒的鑒定

將膠回收的PCR產物連接到pUCm-T載體并轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，獲得重組質粒。PCR鑒定重組質粒，結果為陽性(圖2)；使用內切酶PstⅠ酶切鑒定重組質粒，結果呈陽性(圖3)。

2.3 PCV2全基因核苷酸同源性比較

將鑒定為陽性克隆的重組質粒進行測序，測序發現BH07株和BH11株全長分別為1 767、1 766 bp。從NCBI上收錄的毒株序列中選取8株PCV2基因序列，包含PCV2的5種基因亞型(PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e)的代表毒株和PCV1的代表株。運用DNA Star軟件對其進行同源性分析，由表2可知，BH07株和BH11株與不同亞型的分離株同源性均較高，最高為99.0%，最低為73.3%，其中BH07株與PCV2d代表株AY181946的核苷酸同源性最高，為97.6%；BH11株與AY181946的核苷酸同源性最高，為97.8%；BH07株與BH11株的核苷酸同源性為98.1%。

表2 PCV2全基因核苷酸同源性比較

注：毒株各編號分別代表以下毒株：1為EU148503，2為EU148505，3為GU371908，4為BH11，5為BH07，6為AF055392，7為AF055394，8為AY181946，9為AY660574，10為EF524532。

2.4 PCV2全基因遺傳進化分析

應用軟件MEGA 5.2中的鄰近歸并法繪制遺傳進化樹，系統重復參考值設定為1 000次重復。從繪制的進化樹(圖4)中可見，PCV分成2個完全獨立的大分支，其中8株PCV2構成1個大的分支，其他2株PCV1則組成另一獨立的大分支。本研究獲得的BH07株和BH11株屬于8株PCV2中的組成部分，且與PCV2d代表株AY181946共同構成1個獨立的小分支。由此可知，BH07株和BH11株PCV2均屬于PCV2d基因亞型。

3 討論

歐盟根據PCV2全基因組在進化樹上遺傳距離大小的不同將其分成PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e等5個基因亞型，其中PCV2e和PCV2a均屬于傳統分類方法中的PCV2a，PCV2c、PCV2d和PCV2b均屬于傳統分類方法中的PCV2b。Wang等對中國多個省份病料中的PCV2進行了分離鑒定及亞型區分，首次報道了PCV2d亞型在中國存在[6]。本次試驗的2個毒株經過核苷酸同源性比較和遺傳進化樹的分析驗證，最終確定BH07株和BH11株PCV2均屬于PCV2d基因亞型。PCV2基因組全長為1 766～1 768 bp，本次測序結果BH07株和BH11株全長不一致，分別為1 767、1 766 bp，比較二者基因序列發現BH11株在824位缺失了1個堿基。這與曹東陽等報道的江蘇鹽城地區存在基因大小1 766 bp的PCV2d[7]是一致的。本試驗對鹽城地區2個豬圓環病毒病豬場的病料進行了PCV2全基因組克隆與序列分析，為今后進一步深入研究該病毒的生物學特性及開發有效的免疫制劑提供了科學的參考依據。