中國南陽黃牛HDAC1基因SNP檢測及與生長性狀的相關性分析

楊 穎， 陸 江， 李湘萍， 佘 納， 唐核心， 石德順， 呂祁峰， 徐照學

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004； 2.上海交通大學附屬上海市第九人民醫院，上海 200002；3.湖北醫藥學院麻醉學研究所及附屬太和醫院麻醉科，湖北十堰 442000； 4.河南省畜牧研究所，河南鄭州 476800)

南陽黃牛為中國五大良種黃牛之一，2006年被列入國家畜禽遺傳資源保護名錄，役肉兼用。肉牛的生長性狀和屠宰性狀是其最重要經濟性狀之一。而牛的胴體和肉質都受遺傳因素影響，并可以從DNA水平上加以選擇、操作[1-2]。組蛋白去乙酰化在基因轉錄及信號轉導、細胞增殖和細胞分化方面發揮重要作用[3-6]。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)與基因的轉錄活動有關。研究表明，不活躍的染色質呈去乙酰化狀態，而轉錄活躍區域核小體組蛋白高度乙酰化[3-6]。本試驗主要探討南陽黃牛HDAC1基因的區域位點多態性，以及其與經濟性狀的關聯性，以期為南陽黃牛的遺傳育種和改良提供參考，為新品系的培育提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

河南南陽純種黃牛血液樣品15頭份，均來自南陽黃牛保種場。

1.2 引物設計

HDAC1基因Intron 4-Intron 5區擴增片段引物：

上游引物：5′-GGACTTTGTGACAGGCTTG-3′，下游引物：5′-GGAGAGGGAAGTGGGAAC-3′，Tm：60 ℃。

HDAC1基因Intron 10-Intron 11區擴增片段引物：

上游引物：5′-CCACACACCCCTAATTGAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTCAGAAGAGCCTACA-3′，Tm：57 ℃。

HDAC1基因3′UTR區擴增片段引物：

上游引物：5′-GGGCACACATTACTTTTCTAGTA-3′，下游引物：5′-TGTACCATTTTATTACAAAGATTC-3′，Tm：55 ℃。

1.3 PCR擴增產物處理及DNA序列比對

由北京艾德萊生物科技有限公司瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒完成純化、回收，回收后由寶生物公司進行DNA測序，經過Ebi在線軟件比對分析。

1.4 SSCP-PAGE

蛋白產物加入變性緩沖液后高溫變性，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后硝酸銀染色。

1.6 統計方法

依據參考文獻[1-2]所述方法利用SAS統計軟件進行分析，具體模型：Y=μ+G+bX+e，其中Y為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應(包括加性效應和顯性效應)，b為屠宰體質量的回歸系數，X為屠宰體質量，e為殘差。

2 結果與分析

2.1 南陽黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段位點多態性檢測

通過測序比對分析，未發現Intron 4-Intron 5片段存在位點多態性(表1)。

表1 南陽黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段序列比對

南陽黃牛混合DNAHDAC1基因Intron 4-Intron 5片段PCR-SSCP檢測結果顯示，未發現復合多條帶，未出現多態性(圖1-B)。結合DNA-PCR產物測序和PCR-SSCP方法，在已測南陽黃牛群體中，HDAC1基因在Intron 4-Intron 5片段無多態性位點。

2.2 南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段的位點多態性檢測

南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段PCR擴增產物純化回收測序，經Ebi在線軟件比對分析得出，HDAC1基因在Intron 10-Intron 11片段依自己測序順序的第110 bp處有1個多態性位點，為A/G突變(表2)。

根據測序圖譜判斷，多態性位點基因型分別為：GG純合子、AA純合子和AG雜合子3種基因型(圖2-B至圖2-D)。

2.3 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR非翻譯區多態性位點檢測

南陽黃牛HDAC1基因3′非翻譯區擴增產物純化回收后測序，經過Ebi在線軟件比對分析結果。由表3可知，在南陽黃牛目標群體中HDAC1基因3′-UTR非翻譯區序列有2個突變位點。結合測序圖譜，依自己測序順序的第49 bp處位點基因型分別存在A/C堿基型突變，基因型分別為AA純合子、AC雜合子(圖3-B、圖3-C)；第 199 bp 處位點存在T/C堿基多態性，基因型為TT純合子和TC雜合子(圖3-D、圖3-E)。

2.4 南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區和3′-UTR非翻譯區基因型頻率分布

統計分析，南陽黃牛HDAC1基因的Intron 10-Intron 11區和3′-UTR非翻譯區的堿基多態性位點基因及基因型頻率。由表4可知，Intron 10-Intron 11區110 bp處的A/G多態性位點基因型為GG的個體占53%，基因型為AG的個體占33%，純合子AA基因型占比最小，僅占14%。其中G等位基因核苷酸占總堿基數的70%，A等位基因核苷酸占總堿基數的30%。

由表5可知，在3′-UTR非翻譯區的2個SNP位點中，在 49 bp位點處的A/C突變， AA基因型頻率(67%)遠大于AC基因型(33%)，而CC基因型的頻率為0%；在核苷酸總百分比上，84%為A核苷等位基因，C核苷等位基因僅占16%。

由表6可知，在3′-UTR非翻譯區第199 bp位點處的T/C多態性突變中，未發現CC基因型，TT基因型和TC基因型分別占到了58%和42%；在總核苷酸數量的比例上，T核苷等位基因占到了79%，C核苷等位基因僅占到了21%。

2.5 南陽黃牛HDAC1基因多態位點與經濟性狀關聯分析

2.5.1 南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)SNP突變位點與經濟性狀關聯性分析 應用SAS軟件reg和glm程序，進行南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區不同突變位點基因型與包括胸圍、坐骨端寬、體高、體長等表現型性狀進行遺傳效應估計和關聯性分析。結果表明，AG基因型的南陽黃牛，腰角寬(cm)和體長(cm)明顯高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南陽黃牛，日增質量(kg)明顯高于AG基因型(P<0.05)。其余生長性狀在不同基因型個體中比較無顯著差異。A加性效應和A/G顯性效應在體長(cm)、腰角寬(cm)、日增質量(kg)生長性狀上存在差異顯著(表7)。上述加性和顯性效應結果提示此SNP突變位點可為分子育種培育優秀品種提供一定的參考價值。

2.5.2 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區A/C(49bp)SNP突變位點與經濟性狀關聯性分析 分析發現，體長性狀AC基因型群體比AA基因型群體明顯升高，二者差異極顯著(P<0.01)。體高(cm)、尻長(cm)、十字部高(cm)和日增質量(kg)，AC基因型群體比AA基因型群體升高明顯，差異達顯著水平(P<0.05)，但它們均沒能達到極顯著水平。AC基因型相較于AA基因型群體，在經濟性狀方面有如此多的顯著優異特性，提示此SNP多態性位點可為分子育種提供參考(表8)。

2.5.3 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區T/C(199 bp)SNP突變位點與經濟性狀關聯性分析 由表9可知，與生長性狀關聯分析發現不同基因型個體在各性狀中均無顯著差異(P>0.05)。

表3 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR非翻譯區序列比對

3 結論與討論

基因加性效應又稱為“育種值”，是等位基因的累加效應，上下代可以固定遺傳。本研究中南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)SNP突變位點出現3種基因型，雜合子AG和純合子AA、純合子GG。結果表明，AG基因型的南陽黃牛在腰角寬(cm)和體長(cm)顯著高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南陽黃牛日增質量(kg)顯著高于AG基因型(P<0.05)。其余生長性狀在不同基因型個體中比較無顯著差異。A加性效應正值說明純合型AA比GG有增加性狀值的趨勢，負值則反之。若加性效應達到顯著水平(P<0.05)，表示其可信度>95%，育種值高。A加性效應和A/G顯性效應在體長(cm)、腰角寬(cm)、日增質量(kg)生長性狀上存在差異顯著[1-2]。顯性效應是基因位點內等位基因之間的互作效應，能遺傳但不能固定，是主要產生雜種優勢的部分[1-2]。本研究中南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)SNP突變位點A/G顯性效應在體長(cm)、腰角寬(cm)、日增質量(kg)生長性狀上存在差異顯著。上述加性效應和顯性效應結果提示，此南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)SNP突變位點可能為分子育種培育優秀品種提供一定的參考價值[7-10]。

本試驗在南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區發現了2個突變位點，分別為A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP突變位點[1，11-15]。應用SAS軟件分析了南陽黃牛HDAC1基因 3′-UTR 區A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP 2個突變位點與腰角寬、尻長、十字部高、日增質量、體質量、體長、體高、胸圍、坐骨端寬、管圍等生長性狀的關聯評估分析發現，南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區A/C(49 bp)SNP突變位點對南陽黃牛體長性狀產生極顯著影響，即AC基因型群體比較于AA基因型群體，體長增加極顯著(P<0.01)。在體高(cm)、尻長(cm)、十字部高(cm)和日增質量(kg)方面，AC基因型比AA基因型升高亦明顯，差異達顯著水平(P<0.05)，但沒能達極顯著水平。AC基因型相較于AA基因型群體，在經濟性狀方面有如此多的顯著優異特性，提示此SNP多態性位點可為分子育種提供重要參考，可作為提高經濟性狀的優良育種目標基因選擇[1，16-20]。

表4 南陽黃牛Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)多態性位點基因型頻率和等位基因頻率分布

表5 南陽黃牛3′-UTR非翻譯區A/C(49 bp)突變位點基因 型頻率和等位基因頻率分布

表6 南陽黃牛3′-UTR非翻譯區T/C(199 bp)突變位點基因 型頻率和等位基因頻率分布表

表7 南陽黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區A/G(110 bp)SNP突變位點與經濟性狀關聯性分析結果

注：估計值均為最小二乘均數±標準誤。在同一比較組內，字母不同表示二者之間差異顯著；其中小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。在基因效應比較中，加性效應正值表示A等位基因升高性狀表型值；加性效應負值表示A等位基因降低性狀表型值；“*”表示P<0.05，效應顯著。下表同。

南陽黃牛HDAC1基因mRNA 3′-UTR非翻譯區T/C(199 bp)SNP位點與生長性狀關聯性分析發現，各性狀在不同基因型群體的均值均無顯著差異。因此，本研究提示此SNP多態性位點不可成為分子育種的理想基因型標記選擇。

單核苷酸多態性(SNP)可能直接影響表達水平或蛋白質結構變化[7-10，16-20]。本研究在南陽黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5區SNP位點多態性的檢測中，使用PCR-SSCP的方法分析是否存在多態性，以及聯合PCR產物直接測序方法同時使用，可以盡量避免假陰性結果。

表8 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區A/C(49 bp)SNP 突變位點與經濟性狀關聯性分析

注：CC基因型頻率為0%。

表9 南陽黃牛HDAC1基因3′-UTR區T/C(199 bp)SNP 突變位點與經濟性狀關聯性分析

注：CC基因型頻率為0%。