黃酒中“焦糖香”特征香氣物質葫蘆巴內酯的檢測及風味貢獻研究

王程成，陳雙，王棟，徐巖

(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，工業生物技術教育部重點實驗室，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫,214122)

黃酒是我國民族特色酒精飲料，其營養豐富、風味獨特，深受我國和世界消費者的喜愛。“焦糖香”是我國黃酒具有的重要感官特征，是描述黃酒香氣特征的7個主要描述詞之一[1]。前期有研究采用氣相色譜-嗅聞技術(gas chromatography-olfactometry，GC-O)首次研究發現葫蘆巴內酯是構成甜型黃酒“焦糖香”特征香氣的關鍵香氣化合物[2]，但對于我國黃酒中葫蘆巴內酯的含量分布情況及其對風味的貢獻還缺乏系統的研究。

葫蘆巴內酯(sotolon)，又名3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)呋喃酮，是一種香氣強烈的手性內酯化合物，在空氣中的閾值僅為0.02 ng/L[3]。葫蘆巴內酯在食品中香氣表現復雜，低質量濃度時呈現焦糖、醬油的香氣特征，而在較高質量濃度時則呈現咖喱的香氣特征[4]。大量研究發現葫蘆巴內酯是構成眾多食品(如葡萄酒、陳年日本清酒、咖啡、醬油、糖漿等)香氣特征的關鍵香氣化合物[5-7]。由于葫蘆巴內酯獨特的感官特征，其在釀造酒中的風味功能尤其受到關注。早在1976年DUBOIS等人首次在法國金黃葡萄酒(Vin Jaune)中發現了葫蘆巴內酯的存在[8]，同年TAKAHASHI等人研究發現葫蘆巴內酯是構成陳年清酒“焦糖香”特征的關鍵香氣物質[9]。隨后近半個世紀的研究逐步明確葫蘆巴內酯是構成多種類型葡萄酒香氣特征的關鍵香氣化合物，如貴腐葡萄酒(Botrytised wine)[10]、雪利酒(Sherry wine)[11-12]、馬德拉酒(Madeira wine)[13]、波特酒(Port wine)[14-15]等。由于葫蘆巴內酯在酒中的重要風味作用，對該物質的分析監控成為很多發酵酒品質控制的重要手段。

由于葫蘆巴內酯具有極性大、穩定性差，且在飲料酒中含量低，對該物質的準確分析檢測具有較大的挑戰。常用的固相微萃取技術、攪拌棒吸附萃取技術等樣品前處理方法難以對該物質進行有效的富集。早期對該物質的檢測一般采用大樣品量液液萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)進行分析[13, 15-16]，但該方法存在有機溶劑用量大、操作繁瑣、勞動強度大的缺點。陳雙等人[2]開發了基于固相萃取技術(solid-phase extraction，SPE)及微管大體積進樣技術(microvial insert large volume injection，LVI)聯合GC-MS測定黃酒中葫蘆巴內酯含量的方法，但該方法需要用到專用的設備，難以推廣應用。為了研究葫蘆巴內酯在黃酒中的風味貢獻并對風味品質進行監控，急需開發一種簡單、快速測定黃酒中葫蘆巴內酯含量的方法。

因此，本研究基于液液微萃取(liquid-liquid microextraction，LLME)結合GC-MS技術建立了黃酒中“焦糖香”特征香氣物質葫蘆巴內酯的快速檢測方法，并進一步研究了該物質在黃酒中的分布情況及風味貢獻。研究結果將有助于增進對黃酒風味化學理論的認識和風味品質的控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葫蘆巴內酯(純度 ≥97.0%，GC)，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(內標，98%，GC)，戊烷(色譜純)和正構烷烴(C5-C30)購買于Sigma-Aldrich(中國上海)公司。Na2SO4、NaCl及乙醚(分析純)購買于中國國藥上海化學試劑公司。乙醇(色譜純)購買于百靈威科技有限公司。二氯甲烷(色譜純)和巴斯德吸管購買于上海安譜科學儀器有限公司。實驗用水為Milli-Q超純水。

市售黃酒樣品(24個樣本，來自4個不同地區)。其中浙江地區共10種黃酒分別命名為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9、Z-10，江蘇地區包括7種黃酒分別命名為J-1、J-2、J-3、J-4、J-5、J-6、J-7，上海地區包括3種黃酒分別命名為S-1、S-2、S-3，其他地區包括4種黃酒分別命名為：Q-1、Q-2、Q-3、Q-4。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀：氣相色譜(GC 6890N)-質譜(MS 5975)，安捷倫公司(美國)；多功能自動進樣器，德國Gerstel公司；漩渦振蕩儀(GENIUS 3)，IKA；氮吹儀(organomation N-EVAP)，上海安譜；電子天平，Mettler-Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取20 mL黃酒于60 mL的樣品瓶中，加入內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(100 mg/L，40 μL)及20 mL飽和NaCl溶液混勻，再加入5 mL CH2Cl2作為萃取劑。將混合樣品瓶放置于渦旋振蕩儀上以500 r/min振蕩萃取5 min，靜置30 min分層后，使用巴斯德吸管將下層有機相轉移至10 mL的樣品瓶中，加入無水Na2SO4過夜后，氮吹濃縮至1 mL，貯存在-20 ℃條件下，等待進樣。

1.3.2 GC-MS條件

氣相色譜-質譜聯用儀：氣相色譜(GC 6890N)-質譜(MS 5975)；色譜柱：DB-FFAP毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫公司)。GC條件：氦載氣，流速1 mL/min，初始柱箱溫度50 ℃，維持2 min，6 ℃/min上升至230 ℃，維持15 min。進樣口溫度250 ℃，不分流模式，進樣量1 μL。MS條件：溶劑延遲時間為8 min ，EI電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質譜掃描范圍35～350 amu。分析過程采用選擇離子監測(SIM)模式，選擇離子為83、128、121、178。其中83、128和121、178分別作為葫蘆巴內酯和內標的定性定量離子。

1.3.3 標準溶液的配制

用色譜純乙醇及超純水配制模擬黃酒基質溶液(含5.0 g/L乳酸，pH=4.5，酒精度為15% vol)備用。準確稱取一定質量葫蘆巴內酯標準品溶解于色譜級乙醇中配置成葫蘆巴內酯母液(10 000 mg/L)。吸取一定體積葫蘆巴內酯母液在模擬黃酒溶液中配置成一系列不同質量濃度的標準溶液。將標準溶液按照上述樣品前處理方法處理后進行GC-MS分析，采用安捷倫工作站進行標準曲線的制作。

1.3.4 黃酒中葫蘆巴內酯定性定量

定性：葫蘆巴內酯的定性首先與NIST 08(Agilent Technologies Inc.)質譜庫中標準譜圖對比匹配、文獻中葫蘆巴內酯的保留指數比對進行初步鑒定，然后與葫蘆巴內酯標準物質質譜圖及保留指數比對并進行進一步定性。

定量：采用內標標準曲線法對葫蘆巴內酯進行定量，將目標物與內標的質量濃度比值、峰面積比值分別作為橫縱坐標進行標準曲線的制作。將樣品中的目標物與內標的峰面積比值代入標準曲線進行黃酒樣品中葫蘆巴內酯質量濃度的計算。

1.3.5 方法學驗證

回收率：通過標準曲線及樣品分析可以明確葫蘆巴內酯在黃酒中的含量，在黃酒樣品中加入葫蘆巴內酯標準品，并進行GC-MS分析。根據計算公式進行回收率R的驗證:

式中:C0為加標前樣品中的葫蘆巴內酯質量濃度；C1為添加進樣品中的葫蘆巴內酯質量濃度；C2為加標后黃酒中葫蘆巴內酯質量濃度。

精密度：對同一樣品進行GC-MS分析，根據測得的含量進行精密度驗證。當日精密度實驗設計為同一天早中晚分別測定同一組樣品3次，以其相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示；隔日精密度為連續3 d進樣同一組樣品，同樣以RSD表示。以上過程重復3次。

1.3.6 黃酒中葫蘆巴內酯閾值測定

根據文獻報道的閾值測定的方法[17-18]，在模擬黃酒酒樣(15%vol乙醇-水溶液，含5.0 g/L乳酸，pH=4.0)中添加葫蘆巴內酯標準品，首先進行預實驗，初步測定嗅覺感知的質量濃度范圍，預計能聞到的大概質量濃度范圍后，在這個質量濃度范圍左右配制7種不同質量濃度葫蘆巴內酯溶液。24位經過訓練的品評員(22～26歲)參加閾值測定，從低質量濃度開始，逐一用三杯法，其中2杯是黃酒模擬酒樣，另1杯是添加葫蘆巴內酯的模擬黃酒(杯子以隨機3位數進行編碼)，品評員需在進行測試過程中記錄下自己感知到的3杯黃酒中明顯不同的一杯的序號。

2 結果與分析

2.1 萃取方法及萃取劑的選擇

由于葫蘆巴內酯極性較強且化學性質不穩定，萃取溶劑的選擇對分析效果有決定性的影響。本研究比較了二氯甲烷、乙醚、戊烷對黃酒中葫蘆巴內酯萃取效果的影響。采用20 mL酒樣，分別加入5 mL的不同萃取劑，萃取后分離出萃取劑濃縮至1 mL后進行GC-MS分析，得到的譜圖如圖1所示，從該化合物的響應可看出3種溶劑萃取效果：二氯甲烷>乙醚>戊烷。通過對3種溶劑萃取的樣本進行樣品加標回收率的測試發現，二氯甲烷萃取后的樣品回收率較高(>89%)。綜合萃取效果及回收率等因素，最終選取二氯甲烷作為黃酒中葫蘆巴內酯的萃取劑。

圖1 不同溶劑對黃酒中葫蘆巴內酯萃取效果的影響Fig.1 The effects of different solvents on the extraction of sotolon in Chinese rice wine

2.2 定量離子的選擇

通過在樣品中加入內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮萃取后進行全掃描(Scan)發現葫蘆巴內酯的峰型不佳，且干擾離子較多，對準確定量影響較大。根據葫蘆巴內酯和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的標準質譜圖分析(圖2)，發現葫蘆巴內酯的特征離子中83和128相對其他特征離子來說干擾較小，因此選擇其作為葫蘆巴內酯的定量離子，而內標則選擇121與178作為其定量離子，采用選擇離子監測模式(SIM)進行定量分析。圖3為SIM模式下的樣品分析色譜圖，圖中截取了葫蘆巴內酯及內標的色譜圖，葫蘆巴內酯與4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的出峰時間分別在30.223 min和31.647 min左右。SIM模式相對全掃描模式來說針對性更強，更具選擇性，峰型更好，能夠較好的實現極微量目標物的檢測。

圖2 Scan模式下葫蘆巴內酯及內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質譜圖Fig.2 The mass spectrum of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl)-2-butanone in full scan mode

圖3 SIM模式下葫蘆巴內酯及內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的色譜圖Fig.3 The chromatogram of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl) -2-butanone in SIM mode

2.3 標準曲線及方法學參數的驗證

2.3.1 標準曲線、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限

在模擬黃酒中配制一系列質量濃度梯度的葫蘆巴內酯標準溶液進行標準曲線的制作。通過安捷倫工作站分析獲得黃酒中葫蘆巴內酯定量標準曲線，具體方法學參數見表1。結果顯示葫蘆巴內酯標準曲線的線性良好，R2=0.994。以信噪比(S/N)為3的質量濃度0.66 μg/L作為方法的檢出限，以信噪比(S/N)為10的質量濃度1.02 μg/L作為方法的定量限，其定量限及檢測限都遠遠低于該化合物在黃酒中的含量，也低于前期基于SPE-LVI-GC-MS方法的定量限。

表1 基于液液微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術定量黃酒中葫蘆巴內酯的方法學參數Table 1 Quantitative determination of sotolon in Chinese rice wine based on liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry

2.3.2 回收率及精密度

將葫蘆巴內酯標準品加到4個實際樣品中，每個樣品重復測定3次，計算其回收率及相對標準偏差(表2)，結果顯示所有樣品中測定的回收率均在80%～120%之間，且RSD在10%以內。當日精密度及隔日精密度的RSD均在10%以內，說明該方法滿足黃酒中微量物質的定量要求。

表2 不同樣品中葫蘆巴內酯加標回收率及精密度(n=3)Table 2 The recovery rate and precision of sotolon in different rice wine samples (n=3)

2.4 不同地區黃酒中葫蘆巴內酯的分布規律

采用本研究建立的LLME-GC-MS方法對我國不同地區的24個黃酒樣品中葫蘆巴內酯含量進行了定量分析。結果顯示在所有分析的黃酒樣品中均能檢測到葫蘆巴內酯的存在，說明該化合物在黃酒中普遍存在。表3列出了不同地區黃酒中葫蘆巴內酯含量分布情況，結果顯示本研究分析的市售黃酒中葫蘆巴內酯含量在42.05～244.34 μg/L之間，且不同地區黃酒中葫蘆巴內酯含量差異明顯。浙江與上海地區的黃酒中葫蘆巴內酯含量均在100 μg/L以上，最高含量達到244.34 μg/L(Z-6)。但是其他地區(含量在52.49～79.18 μg/L)及江蘇地區(含量在42.05～81.05 μg/L)的黃酒中葫蘆巴內酯含量則是明顯低于浙江和上海地區的黃酒。從圖4的箱型圖可直觀看出各地區黃酒中葫蘆巴內酯含量分布情況，圖中結果顯示浙江及上海地區的黃酒中葫蘆巴內酯含量明顯高于其余兩個地區的黃酒。此外，通過單因素方差分析對4個地區黃酒中葫蘆巴內酯含量進行了差異性比較，結果顯示浙江地區黃酒中葫蘆巴內酯與江蘇及其他地區黃酒中葫蘆巴內酯含量均存在顯著性差異(p<0.001)，而上海地區黃酒與江蘇及其他地區黃酒中葫蘆巴內酯含量也存在顯著性差異(p<0.05)，這說明葫蘆巴內酯可能是區分不同區域黃酒風味差異的關鍵香氣物質之一。

表3 不同地區黃酒中葫蘆巴內酯含量及OAVTable 3 The concentration and OAV of sotolon in Chinese rice wine in different regions

注：平均質量濃度為3次平行實驗的平均質量濃度；SD為相對標準偏差。

為了進一步研究葫蘆巴內酯對黃酒的風味貢獻，采用文獻中報道的方法首次測定了黃酒中葫蘆巴內酯的香氣閾值，黃酒中葫蘆巴內酯在黃酒基質中的香氣閾值為11 μg/L，是黃酒中典型的“量微香大”的香氣化合物。

香氣活力值(odor activity value，OAV)表示香氣化合物質量濃度與閾值的比值，是目前研究香氣化合物香氣貢獻的有效方法。當化合物在酒中含量超過其閾值，即OAV≥1，說明該物質對酒的整體香氣是有貢獻的[19]。通過測定的黃酒中葫蘆巴內酯的香氣閾值及市售酒中葫蘆巴內酯含量進行OAV的計算，從表3可明顯看出葫蘆巴內酯在所有黃酒中的OAV均大于4，其中，江蘇地區及其他地區黃酒中OAV在4～7之間，浙江及上海地區的黃酒中OAV大于等于10，說明該化合物對黃酒香氣具有重要貢獻。從圖4的箱型圖同樣可直觀地看出所有黃酒中葫蘆巴內酯質量濃度均在閾值(11 μg/L)之上，其對黃酒的整體香氣有極大的貢獻。

圖4 不同區域黃酒中葫蘆巴內酯含量分布Fig.4 The concentration of sotolon in Chinese rice wine from different Regions

3 結論

本研究基于液液微萃取結合GC-MS技術建立了黃酒中“焦糖香”特征香氣物質葫蘆巴內酯含量的檢測方法。該方法檢測限低至1.02 μg/L，測定準確性和精密度良好。該方法具有樣品用量少，簡單快速的特點，能夠滿足黃酒中關鍵香氣葫蘆巴內酯批量快速檢測的需要。采用該方法分析了不同地域24款典型黃酒樣品中葫蘆巴內酯的含量，結果顯示該物質在黃酒中普遍存在，且含量在42.05～244.34 μg/L之間。首次測定了黃酒基質中葫蘆巴內酯的香氣閾值(11 μg/L)，并基于OAV研究了葫蘆巴內酯在黃酒中的風味作用，結果顯示所有測定樣品中葫蘆巴內酯含量均高于其香氣閾值，表明該物質對黃酒整體香氣具有重要影響。進一步比較分析發現葫蘆巴內酯在浙江和上海地區黃酒中含量顯著高于其余地區黃酒，表明葫蘆巴內酯可能是一個能區分不同區域黃酒的潛在標志性化合物。