基于氣相色譜-質譜聯用技術結合電子鼻評價浸米時間對黃酒風味品質的影響

楊成聰，劉丹丹，葛東穎，石星星，王強，郭壯

(湖北文理學院 食品科學技術學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

作為黃酒生產的前端工藝，浸米對黃酒品質具有直接的影響[1]。浸泡可使糯米中的淀粉充分吸水，進而有利于糯米后續的蒸煮[2]。此外，產乳酸細菌可利用糯米的水溶性營養物質大量繁殖，在降低前酵醪pH值的同時抑制了雜菌的生長，進而保障了黃酒發酵的順利進行[3]。黃酒浸米水中的細菌主要為植物乳桿菌和短乳桿菌[4]。有研究表明，采用米漿水替代部分投料用水可明顯抑制其他產酸細菌的代謝活動[5]，進而賦予酒體更協調的風味[6]。浸米時間通常為5～20 d，時間過短，糯米不能充分吸水且不能使漿水達到一定酸度，從而不利于黃酒揮發性風味物質的形成；若時間過長，總糖、還原糖、粗脂肪和粗蛋白等主要組分流失嚴重，亦不利于黃酒揮發性風味物質的形成[7]，因而研究浸米時間對黃酒風味品質的影響就顯得尤為重要。

研究人員常使用氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)和電子鼻對食品的風味進行評價。GC-MS可同時獲得食品中揮發性風味物質保留時間與分子結構兩方面信息，在白酒[8]、紅酒[9]和酸奶[10]等發酵食品中已有廣泛應用。通過模擬人體嗅覺系統，電子鼻傳感器陣列實現了不同種類化學物質的快速無損檢測，在酒齡辨別[11]、品牌區分[12]和風味分析[13]中亦有著廣泛的應用，具有檢測結果客觀性強且受主觀因素影響小的優點。

本研究采用GC-MS和電子鼻聯用技術對不同浸泡時間糯米釀造黃酒中揮發性風味物質的種類及含量進行了分析，同時結合多元統計學方法探討了浸米時間對黃酒風味品質的影響，以期為后續黃酒品質的提升和工藝的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米：市售；生麥曲：購于浙江省麗水市；黃酒專用釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；NaCl：西隴科學股份有限公司。

PEN3電子鼻，配備10 個金屬氧化傳感器,德國Airsense公司；GCMS-QP2020氣相色譜質譜聯用儀，配有電子轟擊電離源EI,日本島津公司；SH-Rtx-Wax(30 m×2.25 mm×0.25 μm)色譜柱,日本島津公司；HMT-100蒸飯柜,廣東樂創電器有限公司；LRH-250F生化培養箱,上海一恒科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制作

分別稱取700 g糯米洗凈后于20～22 ℃浸泡1、3、5、7、9、11、13、15和17 d，蒸煮30 min，采用攤飯法冷卻至37 ℃，加入0.7 g酒曲、110 g生麥曲、410 mL糯米浸泡液和550 mL清水攪拌均勻后置于28 ℃生化培養箱培養14 d，后置于18 ℃培養7 d，取上清液制成供試樣液[14]。

1.2.2 基于GC-MS技術黃酒中揮發性風味物質的測定

(1)樣品處理。取黃酒樣品9 mL于20 mL樣品瓶，加入3 g NaCl，采用帶有聚四氟乙烯的鋁帽夾緊封口60 ℃攪拌預熱15 min，平衡15 min，進樣量1 μL，進樣口解析5 min后進入GC-MS 分析[19]。

(2)GC條件。色譜柱：SH-Rtx-Wax，30 m×2.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度200 ℃；進樣方式：分流進樣；分流比為10：1；載氣為高純氦氣(>99.999 9%)和高純氮氣(>99.999 9%)；流速：1 mL/min；升溫程序：起始溫度30 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升到45 ℃，保持10 min，然后以8 ℃/min升到130 ℃，不保持，然后以10 ℃/min升到200 ℃保持7 min。

(3)MS 條件。離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；連接口溫度：280 ℃；電子轟擊能量70 eV；m/z范圍：33.00～450 amu；采集方式：Q3 Scan。

(4)定性分析。NIST14標準質譜庫定性；保留指數定性。

(5)定量分析。利用峰面積對樣品中主要組分進行相對含量分析。

1.2.3 基于電子鼻技術測定黃酒中揮發性風味物質

取黃酒樣品10 mL，稀釋2倍后置于120 mL樣品瓶中使用電子鼻進行氣味檢測。檢測器由10 個金屬氧化傳感器組成，分別對不同類型揮發性風味物質進行測定。測定前傳感器進行95 s自動清潔，樣品測試時間為60 s，每間隔1 s測定一個響應值。響應值為傳感器測試樣品時的電阻G和測試空氣的電阻GO的比值，比值與1的偏離度越大，說明與之相對應的揮發性風味物質的濃度越大。電子鼻化學傳感器及其對應的敏感物質類型如表1所示[15]。

1.2.4 統計學分析

使用聚類分析(cluster analysis，CA)和主成分分析(principal component analysis，PCA)對不同浸米時間黃酒風味整體結構的差異性進行分析；使用曼-惠特尼檢驗(mann-whiney test)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)對與浸米時間顯著相關揮發性風味物質進行甄別。使用Canoco 4.5軟件做RDA，其他分析使用Matlab 2010軟件；使用Matlab 2010軟件繪制熱圖，其他圖使用origin 8.5繪制。

表1 化學傳感器及其對應的敏感物質類型Table 1 Chemical sensors and their corresponding sensitive material types

2 結果與分析

2.1 基于GC-MS技術浸米時間對黃酒揮發性風味物質的影響

該文首先利用GC-MS技術對黃酒樣品中揮發性風味物質進行了定性和相對定量分析，結果見表2。

表2 不同浸米時間黃酒揮發性組分及相對含量分析 單位：%Table 2 The relative abundance of volatile components of Chinese rice wine fermented by glutinous rice soaked at different times

續表2

序號物質名稱浸米時間/d1 d3 d5 d7 d9 d11 d13 d15 d17 d10十二甲基環己硅氧烷0.08-0.220.150.110.10.250.280.1411乙酸異戊酯1.51.841.08-1.420.820.390.41-12正己酸乙酯0.280.310.21-0.310.160.222.982.5513(S)-乳酸乙酯-----0.190.40.33-14醋酸-------0.551.34152,3-丁二酮------0.740.66-16乙酸苯乙酯--0.070.10.070.05---17乙酸乙烯酯--0.540.30.280.48---18十四甲基環庚硅氧烷0.13-0.27-0.050.030.340.250.0419癸酸乙酯0.090.060.140.280.160.120.110.110.0520十六烷基環十八烷基硅氧烷--0.07---0.070.07-21十四烷酸乙酯---0.050.030.05---22辛酸乙酯0.180.170.420.550.550.150.320.250.0623苯乙醇0.360.131.32.121.381.020.760.770.4924羰基硼烷0.860.890.40.510.380.380.40.380.4325丁酸異戊酯-------0.05-263-苯丙酸乙酯--------0.127(R)-2-戊醇--------0.1128八甲基環四硅氧烷-------0.13-29甲基乙酰甲醇--------0.28302-戊酮--------0.8531十甲基環戊硅氧烷0.060.050.060.170.10.08-0.20.1532乳酸乙酯--------2.77332-甲氧基乙酸乙酯--------5.83343-甲基-4-氧代戊酸11.3913.3610.48-10.611.5813.078.238.8635乙酸異丁酯0.33---0.24----36(S)-L-丙氨酸乙基酰胺--0.750.850.670.60.570.680.7137乙酸異丁酯-0.33-------38乙醇0.420.190.120.140.130.150.170.130.1739甘油縮甲醛02.19-------40乙縮醛2.21--------412,3-丁二醇-0.37-------42甲酸14.3213.7713.8317.0113.3115.1614.5513.6214.85

注：“-”表示未檢出。

由表2可知，9個黃酒樣品中共檢測到42 種揮發性風味物質，其中酯類化合物18 種、醇類化合物10 種、烷烴類化合物6 種、酸類化合物3 種、酮類化合物2 種、醛類化合物2 種和胺類化合物1 種。其中，醇類和酯類化合物為黃酒中主要揮發性風味物質，其平均相對含量分別為62.67%和10.00%。王旭等人研究結果與本研究相同[16]，其采用GC-MS技術對不同酒齡黃酒中關鍵揮發性風味物質進行了研究，結果發現酯類和醇類為金色年華黃酒中主要風味物質。通過對不同品牌黃酒揮發性風味物質進行分析，LUO[17]和CAO[18]亦證實醇類和酯類在黃酒揮發性風味物質的種類和含量上均占優勢。值得一提的是，在浸米時間超過11 d糯米釀造的黃酒中均檢測到了正丁醇和丁酸乙酯，而乙酸苯乙酯、乙酸乙烯酯和十四烷酸乙酯只能在浸米時間≤11 d糯米釀造的黃酒中檢測到。

2.2 與浸米時間顯著相關黃酒揮發性風味物質的甄別

在對黃酒揮發性風味物質相對含量解析的基礎上，本研究進一步對不同浸米時間糯米釀造黃酒進行了非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類分析，結果如圖1所示。

圖1 基于聚類分析的浸米時間對黃酒風味品質的影響Fig.1 Effect of soak time of glutinous rice on the flavor quality of Chinese rice wine based on cluster analysis

由圖1可知，黃酒樣品整體上可劃分為兩個聚類，其中聚類I由浸泡1、3、5、7、9和11 d糯米釀造的黃酒構成，而聚類Ⅱ由13、15和17 d樣品構成。由此可見，當浸米時間達到11 d以上時黃酒的風味可能會發生明顯的變化。本研究進一步采用Mann-Whiney分析，對隸屬于兩個聚類黃酒的醇類、酸類、酮類、烷烴類和酯類化合物相對含量進行了分析，其結果如圖2所示。

圖2 隸屬于聚類I和聚類II黃酒樣品揮發性成分的比較分析Fig.2 Comparative analysis of volatile components of Chinese rice wine samples belong to cluster I and II(注：NS，差異不顯著；*，p<0.05。)

由圖2可知，隸屬于聚類I的黃酒樣品其醇、酸和酯類化合物的相對含量分別為69.79%、24.14%和3.27%，而在聚類II中分別為47.78%、25.02%和24.75%。由圖2亦可知，浸米時間達到13 d時黃酒揮發性風味物質中醇類的相對含量顯著下降(p<0.05)，而酯類含量顯著升高(p<0.05)。究其原因可能在于，隨著浸米時間的延長，黃酒中的醇類物質被氧化為酸，而醇與酸又進一步發生了酯化反應[19]。本研究進一步以聚類I/聚類II為分組依據，采用RDA對與浸米時間顯著相關的黃酒揮發性風味物質進行了甄別，結果如圖3所示。

圖3 RDA雙序圖Fig.3 biplot of the RDA

由圖3可知，2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙基硼酸二乙酯、十四烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、甲酸、(S)-乳酸乙酯、正丁醇、2,3-丁二酮和丁酸乙酯等11 種物質與RDA排序圖約束軸上的樣品賦值良好相關，因而代表了與浸米時間顯著相關的揮發性風味物質。其中2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇在聚類I一側，說明這3 種物質在浸泡1～11 d糯米釀造的黃酒中相對含量較高，而其他8 種揮發性風味物質呈現出相反的趨勢。經Mann-Whiney發現，十六烷酸乙酯、乙基硼酸二乙酯和丁酸乙酯3 種酯及2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和正丁醇4 種醇在兩類黃酒中差異顯著(p<0.05)。浸米時間對上述7 種揮發性風味物質相對含量的影響如圖4所示。

圖4 浸米時間對揮發性風味物質相對含量的影響Fig.4 Effect of soak time of glutinous rice on the relative abundance of volatile flavor in Chinese rice wine

由圖4可知，隨著浸米時間的增加黃酒中2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇在13 d時呈現明顯的下降趨勢，乙基硼酸二乙酯、丁酸乙酯和正丁醇在浸米時間達到13 d時呈現明顯的上升趨勢。

2.3 基于電子鼻技術浸米時間對黃酒風味品質影響的評價

通過CC-MS法研究發現，當浸米時間達到11 d以上時黃酒的風味可能會發生明顯的變化，本研究進一步采用電子鼻技術對該結論進行了驗證。基于電子鼻技術不同浸米時間黃酒風味品質的PC1與PC2因子載荷圖如圖5所示。

圖5 不同浸米時間黃酒風味品質的PC1與PC2因子載荷圖Fig.5 Graphical representation of the PCA of Chinese rice wine samples fermented by glutinous rice soaked at different times showing PC1 vs.PC2: Factor loading

由圖5可知，第一主成分(PC1)由W5C、W5S和W2W等3 個傳感器檢測的指標構成并占全部變量權重的88.73%，而第二主成分(PC2)主要是由W1C、W3C、W6S、W1W、W2S、W1S和W3S等7 個傳感器檢測的指標組成，占全部變量權重的9.17%。基于電子鼻技術不同浸米時間黃酒風味品質PC1和PC2的因子得分圖見圖6。

圖6 不同浸米時間黃酒風味品質的PC1與PC2因子得分圖Fig.6 Graphical representation of the PCA of Chinese rice wine samples fermented by glutinous rice soaked at different times showing PC1 vs.PC2 Factor scores

由圖6可知，浸泡1、3、5、7、9 d糯米釀造的黃酒樣品主要集中在X軸上方，而浸泡11、13、15和17 d糯米釀造的黃酒樣品主要集中在X軸下方。由此可見，使用電子鼻檢測的結果與GC-MS基本一致，即糯米浸泡時間達到11 d以上時會對黃酒的風味產生明顯的影響。結合圖5可知，隨著浸米時間的延長，傳感器W5C(對烷烴、芳香類物質靈敏)和W5S(對氮氧化物靈敏)的響應值呈下降趨勢，而傳感器W2W(對有機硫化物靈敏)響應值呈上升趨勢。由此可見，當浸米時間達到11 d以上時，釀造黃酒中芳香類物質明顯下降。綜合GC-MS和電子鼻分析發現，浸米時間不應超過11 d，否則會對黃酒風味品質產生負面影響。通過以浸米漿水中總酸含量、乳酸含量及乳酸菌數為指標，姬中偉等認為浸米時間控制在8～12 d時所得漿水對黃酒發酵比較合適[20]，其結論與本研究相符。

3 結論

本研究發現醇類和酯類化合物為黃酒中主要揮發性風味物質，且隨著浸米時間的延長黃酒揮發性風味物質中醇類的相對含量顯著下降，而酯類含量顯著升高。當浸米時間達到11 d以上時，黃酒的風味會發生明顯的變化，且芳香類物質明顯下降。由此可見，以黃酒揮發性風味物質作為考察指標來反應浸米時間對黃酒品質的影響時，浸泡時間控制在11 d內，所得漿水對黃酒發酵比較有利。