超高壓處理對乳清分離蛋白凝膠特性的影響

衛永華 ，劉永娟，楊莉，張志健，劉會平

1(山西師范大學 食品科學學院，山西 臨汾，041000) 2(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中，723000) 3(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津，300457)

超高壓(ultra-high pressure，UHP)處理技術是21世紀備受食品研究者關注的一種食品冷加工技術。與熱處理相同，它也可以引起蛋白質變性、伸展[1-2]，內部疏水基團暴露。若此時蛋白質濃度、pH值、壓力大小、處理時間等因素合適，分子間或分子內的氫鍵、二硫鍵、范德華力、疏水作用力等將相互作用，形成穩定的、包裹有水分或其他成分的三維網狀結構，即超高壓凝膠。由于超高壓處理不會破壞氨基酸、維生素、色素和風味物質等低分子化合物中的共價鍵，故可以較大程度地保持食品原材料的色、香、味及營養成分[3-4]，加工出質地、消化性、風味等與熱處理不同的蛋白質凝膠[5-7]。

近幾年來，超高壓技術在乳制品、魚糜制品以及蛋白質凝膠食品中有著廣泛的應用。付強認為鰱魚魚糜經超高壓處理后，不僅凝膠品質顯著提高，而且風味和營養成分損失較小[8]。王安琪等認為，處理壓力的增大有利于提高魚糜樣品的剪切力、硬度、回復性、彈性和咀嚼性，且相關指標顯著優于傳統熱殺菌(巴氏滅菌和高壓蒸汽滅菌)[9]；郭麗萍研究了超高壓結合熱處理對豬肉蛋白質相互作用力的影響，發現處理后的肌原纖維蛋白質巰基含量極顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量、疏水性極顯著上升(p<0.01)[10]。王苑等認為肌原纖維蛋白與大豆分離蛋白經超高壓處理后所得新型凝膠的硬度、彈性及保水性均比傳統熱凝膠要好，且結構光滑致密[11]。

乳清蛋白具有良好的凝膠特性和營養特性，其在凝膠食品的組織結構調整方面具有廣泛的應用[12-14]。然而，目前國內關于超高壓處理對乳清蛋白凝膠影響的研究還未見報道。本研究以乳清分離蛋白(whey protein isolated，WPI)為試驗原料，對其進行不同壓力、時間、WPI濃度、pH值和CaCl2條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理條件對乳清分離蛋白凝膠特性的影響，為乳清蛋白在超高壓凝膠食品中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

乳清分離蛋白(WPI)(采用低溫離子交換技術生產，蛋白質質量分數92%)，購于美國Hilmar公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

HPP.M1型超高壓處理設備，天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；Anke TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；JSM-6380LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社JEOL；TA3XT Plus型質構儀，英國Stable Micro System公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超高壓WPI凝膠制備工藝[15]

使用封口機將配制好的WPI溶液密封于耐高壓的聚乙烯袋中(不留氣泡)，然后放入壓力腔內，浸沒于傳壓介質中，設置壓力和時間參數后進行超高壓處理。處理后樣品置冰箱4℃保藏，所有性質的測定在24h后進行，即只考慮不可逆的變化。

1.3.2 超高壓處理條件對WPI凝膠特性影響的研究

以凝膠強度、保水性和得率為考察指標，分別進行處理壓力(100、200、300、400和500 MPa)、處理時間(10、20、30和40 min)、蛋白質質量濃度(120、140、160、180、200、220 g/L)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和CaCl2濃度(0.03、0.06、0.09、0.12、0.15和0.18 mol/L)的單因素試驗。

1.3.3 WPI凝膠強度的測定[16]

將超高壓處理凝膠用質構儀的TPA軟件系統測定。采用直徑為6 mm的圓柱型探針(P/6)以1 mm/s的恒定速度穿透凝膠，凝膠塊高度為10 mm，直徑24 mm。凝膠的硬度以探針的第一次壓縮循環中的最大力來表示，單位用g表示。所有測定值采用附屬解析軟件分析后直接從電腦中輸出。每個條件取3個樣品測定求其平均值。

1.3.4 WPI凝膠保水性測定[17]

將5 g左右凝膠放入離心管中于5 000×g離心10 min，然后倒出離心管內游離水分，稱重。每個樣品平行測定3次，取其平均值。凝膠的保水性(water-holding capacity，WHC)則為：

WHC/%=(w2/w1)×100

(1)

式中：w1，離心前凝膠的質量，g；w2，離心后凝膠的質量，g。

1.3.5 WPI凝膠得率測定

用吸水紙除去凝膠表面的水分后，稱取凝膠塊質量。凝膠得率計算公式如下：

Y/%=(m2/m1)×100

(2)

式中：m1，超高壓處理前WPI溶液質量，g；m2，超高壓處理后形成凝膠塊的質量，g。

1.3.6 WPI凝膠微觀結構觀察[17]

將凝膠樣品切成2 mm×2 mm×1 mm的小片，用2.5%(體積分數)戊二醛在4 ℃條件下固定16 h，再分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(體積分數)的酒精溶液依次脫水，然后進行冷凍干燥，最后進行離子濺射鍍金處理，用掃描電子顯微鏡觀察凝膠的微觀結構。

1.3.7 WPI凝膠(或溶液)樣品中巰基和二硫鍵含量的測定

超高壓凝膠(或溶液)樣品中的巰基和二硫鍵含量分析采用郭麗萍的Ellman試劑分析法進行[10]。每個樣品平行測定3次，取其平均值。

1.3.8 數據處理

所有試驗結果用平均值±標準誤差表示。試驗數據采用SPSS 19.0數據分析軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 處理壓力對WPI凝膠的影響

2.1.1 處理壓力對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成質量濃度為160 g/L的溶液，分別經100～500 MPa的壓力處理30 min，研究不同壓力對凝膠特性的影響。結果如表1所示。

表1 處理壓力對WPI凝膠特性的影響Table 1 The effects of applied pressure on the properties of WPI gel

注：表中同一指標值所標示字母不同時表示樣品指標有顯著差異(p<0.05)，表2、3、4和5與此相同。

由表1可以看出，WPI溶液經100 MPa和200 MPa壓力處理后不形成凝膠。當處理壓力達到300 MPa時，形成凝膠的強度、得率和保水性均很低。隨著壓力的繼續升高，凝膠強度和保水性均顯著增加(p<0.5)。但WPI凝膠得率在400 MPa具有最大值，隨后呈現降低的趨勢。這意味著變性乳清蛋白在400 MPa時對水分的包裹能力最強，當壓力進一步增大時，可能凝膠網絡結構受到的擠壓作用也隨之增大，造成水分流失，得率下降[18]。

2.1.2 處理壓力對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響

處理壓力對凝膠中巰基和二硫鍵含量影響的結果如圖1所示。

圖1 處理壓力對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.1 The effects of treatment pressure on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP注：圖中同一指標值所標示字母不同時表示樣品指標有顯著差異(p<0.05)，圖3、5、7和9與此相同。

天然β-乳球蛋白中包埋著許多疏基，在超高壓的作用下，β-乳球蛋白分子變性，球狀結構遭到破壞，內部的疏水基團暴露于溶劑當中。新暴露出來的巰基將在氧化作用或巰基/二硫鍵交換作用下形成二硫鍵，從而對WPI凝膠的網絡結構起著重要的穩定作用[10]。由圖1可以看出，隨著壓力增大，凝膠中巰基含量顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量顯著上升(p<0.01)。這表明隨著壓力的增大，WPI分子中越來越多的巰基轉化為二硫鍵，使蛋白質分子間的交聯作用增強，凝膠品質得以提高。

2.1.3 處理壓力對WPI凝膠微觀結構的影響

處理壓力對凝膠微觀結構影響的結果如圖2所示。

由圖2可以看出，當處理壓力為300 MPa時，球狀蛋白分子展開程度低，變性蛋白質之間的交聯作用也少，形成的網絡結構中孔洞較大。隨著壓力的上升，二硫鍵廣泛形成，蛋白質網絡結構越致密，孔洞越細小[19-22]。這一方面提高了凝膠的強度，另一方面增加了凝膠體內毛細管作用力，有利于提高凝膠的持水能力和得率。另有報道，超高壓有助于氫鍵的形成[23]，這也是壓力升高導致凝膠保水性增強的又一原因。

2.2 處理時間對WPI凝膠的影響

2.2.1 處理時間對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成質量濃度為16 g/L的溶液，分別經500 MPa的壓力處理10～30 min，研究不同處理時間對凝膠特性的影響。結果如表2所示。

表2 處理時間對WPI凝膠特性的影響Table 2 The effects of treatment time on the properties of WPI gel

質量濃度為160 g/L的WPI溶液在室溫條件下，經500 MPa處理10 min就可形成凝膠。但由表2可知，處理時間≤20 min時，WPI凝膠強度和得率均較低，保水性也較差；處理時間高于20 min后，凝膠強度、得率和保水性均顯著提高(p<0.5)，但凝膠強度在處理時間超過30 min后，變化不顯著(p<0.5)。有研究表明，超高壓處理雖然可以促進蛋白分子變性、凝聚，但聚合到一定程度時，延長處理時間對蛋白交聯效果影響不再顯著，甚至會導致凝膠已有致密、有序網絡結構的破壞，使其凝膠硬度降低[24]。

2.2.2 處理時間對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

處理時間對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖3所示。

圖3 處理時間對WPI凝膠(或溶液)中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.3 The effects of treatment time on SH group and disulfide bond content in WPI gel or solution processed by UHP

由圖3可以看出，WPI溶液經500 MPa的壓力處理0～20 min時，巰基含量隨處理時間的延長顯著下降(p<0.01)，二硫鍵含量顯著上升(p<0.01)。而當處理時間大于20 min后，巰基含量變化不明顯，二硫鍵的含量仍緩慢增加。但如2.2.1所述，此時二硫鍵含量的增加只引起凝膠得率和保水性能的提高，并未對凝膠強度產生影響。

2.2.3 處理時間對WPI凝膠微觀結構的影響

處理時間對凝膠微觀結構影響的結果如圖4所示。

如圖4所示，在500 MPa壓力、處理時間為10 min時，WPI凝膠主要為顆粒狀聚集物，蛋白質分子之間交聯作用很弱；當處理時間延長至20 min時，蛋白質分子展開程度增大，初步形成一定的網絡結構，但相互之間交聯作用仍然較弱；WPI凝膠表現出較低的凝膠強度、得率和保水性。當處理時間分別為30 min和40 min時，WPI分子間的交聯作用比較充分，網絡結構更加致密，表現出較好的凝膠特性。由此可見，蛋白質凝膠網絡的形成都需要一個過程，并非瞬間完成。

圖4 不同處理時間下超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.4 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different treatment time

2.3 WPI質量濃度對凝膠的影響

2.3.1 WPI質量濃度對凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成120～220 g/L的溶液，分別經500 MPa的壓力處理30 min，研究不同WPI濃度對凝膠特性的影響。結果如表3所示。

表3 WPI濃度對凝膠特性的影響Table 3 The effects of protein concentration on the properties of WPI gel

前期預實驗發現，質量濃度為100 g/L的WPI溶液在室溫下，經500 MPa、30 min高壓處理后不能形成凝膠。由表3可知，當質量濃度增至120 g/L時，即有較低強度的凝膠生成，并且凝膠強度隨著蛋白質濃度的增大而增大。此結果表明，與熱致凝膠相同，一定質量濃度的WPI也是超高壓凝膠形成的基本條件[25]。

在質量濃度為120～220 g/L范圍內，隨著蛋白質質量濃度增加，凝膠得率提高幅度較大(p<0.5)。這說明高蛋白濃度凝膠包裹水分的能力要明顯高于低濃度蛋白凝膠。當WPI質量濃度大于180 g/L時，凝膠保水性呈現下降趨勢(p<0.5)。這可能是對蛋白質網絡較大的包裹能力而言，水分相對不足造成的。

2.3.2 WPI質量濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響

WPI質量濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖5所示。

圖5 蛋白濃度對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.5 The effects of WPI concentration on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖5可以看出，不同WPI質量濃度溶液經500 MPa相同壓力處理后，凝膠中的巰基和二硫鍵含量均隨WPI質量濃度增加而增加(p<0.5)，且較高WPI質量濃度(>160 g/L)凝膠中的二硫鍵含量要高于低質量濃度(<160 g/L)凝膠。這可能與高濃度凝膠中巰基更易碰撞、結合形成二硫鍵有關，也是高質量濃度WPI凝膠的特性整體上優于低濃度凝膠的原因。

2.3.3 WPI質量濃度對凝膠微觀結構的影響

WPI對凝膠微觀結構影響的結果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著WPI質量濃度的增大，蛋白質分子側鏈間相互交聯的機會增大，蛋白質之間的交聯作用逐漸增強，致使凝膠結構越牢固[26]。與此同時，凝膠網絡中的孔洞逐漸減小，質地變得細膩。不同WPI質量濃度凝膠微觀結構的觀察結果與其二硫鍵含量的測定結果相符。

圖6 不同WPI質量濃度的超高壓凝膠掃描電鏡圖Fig.6 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different WPI concentration

2.4 pH對WPI凝膠的影響

2.4.1 pH對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 3.0～7.0、濃度0.06 mol/L的CaCl2溶液中，配制成160 g/L的溶液，分別經500 MPa的壓力下處理30 min，研究不同pH值對凝膠特性的影響。結果如表4所示。

表4 pH值對WPI凝膠特性的影響Table 4 The effects of pH on the properties of WPI gel

pH值可通過改變分子的凈電荷改變分子間的吸引力、排斥力以及分子和溶劑之間的相互作用，從而使不同pH值的蛋白質溶液形成凝膠的特性各不相同[27]。如表4所示，當WPI溶液pH值在乳清蛋白等電點(大約4.5～5.5)時，形成的凝膠強度、得率和保水性均較差。而WPI溶液pH值偏離等電點時，凝膠的品質則會升高，且偏中性環境的凝膠特性更高。

蛋白質在適宜pH值下才能接近到合適的距離，發生分子間的巰基-二硫鍵作用，完成分子交聯。并且只有在二硫鍵與疏水作用力、靜電作用力等達到平衡狀態時，才能形成具有較高強度、得率和持水能力的不可逆性凝膠網絡[25]。當pH值低于乳清蛋白等電點時，WPI凝膠則主要由分子間靜電作用和離子鍵維持，分子間二硫鍵作用很弱，分子間作用力以斥力為主[28]，所形成的凝膠的特性相對較低(p<0.5)；在pH值高于乳清蛋白等電點的時候，凝膠中由分子間二硫鍵發揮主要作用，其各項品質指標均較高；在等電點附近，由于蛋白質分子帶靜電量最少，相互之間靜電排斥也最小，蛋白質分子在展開之前就發生物理性凝聚[26]，因而形成的凝塊缺乏彈性，含水量和得率也較低。但本研究對凝膠保水性評價時，由于凝膠在離心前后水分損失量較小，反而使得凝膠在等電點時表現出較高的保水性。

2.4.2 pH值對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

pH值對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖7所示。

圖7 pH值對WPI凝膠中巰基含量和二硫鍵的影響Fig.7 The effects of pH on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖7可以看出，在接近中性環境中，WPI凝膠中的巰基含量要明顯低于強酸性環境，而二硫鍵含量變化趨勢與巰基相反。這表明中性環境更有利于巰基/二硫鍵之間交換反應的發生。此結果與2.4.1部分中不同pH凝膠的品質表現趨勢相一致。

2.4.3 pH值對WPI凝膠微觀結構的影響

pH值對WPI凝膠微觀結構影響的結果如圖8所示。

圖8 不同pH值下超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.8 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different pH

由圖8可知，WPI溶液pH值在3.0～5.0時，經超高壓處理生成的凝膠中并未表現出明顯的網絡結構，蛋白質分子仍以球狀結構存在(圖8-a、8-b和8-c)，凝膠表現出較差的特性；當WPI溶液pH≥6.0，經高壓處理生成的凝膠中，蛋白質分子展開程度明顯增大，分子間相互作用增強，凝膠網絡也越來越致密(圖8-d、8-e、8-f)。相應地，凝膠的強度、保水性和得率均較高。此結果與不同pH凝膠中的二硫鍵含量測定結果相一致。

2.5 CaCl2濃度對WPI凝膠的影響

2.5.1 CaCl2濃度對WPI凝膠特性的影響

將WPI樣品分別溶解于pH 7.0、濃度0.06～0.18 mol/L的CaCl2溶液中，配制成160 g/L的溶液，分別經500 MPa的壓力下處理30 min，研究不同CaCl2濃度對凝膠特性的影響。結果如表5所示。

表5 CaCl2濃度對WPI凝膠特性的影響Table 5 The effects of CaCl2 on the properties of WPI gel

變性蛋白質分子由于靜電排斥力而保持分離狀態，加入金屬鹽，可以屏蔽這些靜電排斥力，使盡可能多的蛋白質分子相互接近。另外Ca2+可與蛋白質通過氫鍵等形成“鍵橋”，這樣可加速凝膠網絡形成[28]，提高凝膠顆粒硬度[29]。由表5可知，CaCl2在0～0.15 mol/L能夠增加WPI凝膠強度(p<0.5)；當CaCl2濃度大于0.15 mol/L時，則會引起凝膠強度下降，可能原因是上升的CaCl2濃度引起蛋白質的過度聚集，阻止了蛋白質凝膠網絡形成，導致凝膠脆性的增加[30-31]；WPI凝膠得率則隨著金屬鹽濃度的上升呈下降趨勢，可能是由CaCl2用量的增加造成變性蛋白質分子凝集速度過快，網狀結構包裹的水分減少造成的。WPI凝膠保水性在CaCl2濃度為0.06 mol/L時具有最大值，CaCl2濃度進一步上升則會使蛋白質膠凝速度過快，顆粒大小不均勻，毛細管作用降低，最終導致凝膠保水性下降[32]。

2.5.2 CaCl2濃度對WPI巰基和二硫鍵含量的影響

CaCl2濃度對凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響如圖9所示。

圖9 CaCl2對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量的影響Fig.9 The effect of CaCl2 on SH group and disulfide bond content in WPI gel processed by UHP

由圖9可以看出，CaCl2的添加對WPI凝膠中巰基和二硫鍵含量沒有明顯影響(p<0.5)，這表明Ca2+對蛋白質分子中巰基的暴露與二硫鍵的形成沒有影響。

2.5.3 CaCl2濃度對WPI凝膠微觀結構的影響

CaCl2濃度對WPI凝膠微觀結構影響的結果如圖10所示。

圖10 含不同濃度CaCl2的超高壓WPI凝膠掃描電鏡圖Fig.10 The scanning electron microscopic pictures of gels processed by UHP with different CaCl2 concentration

如圖10所示，隨著CaCl2濃度的增加，蛋白質的交聯作用增強，形成的凝聚體顆粒增大，有助于凝膠網絡結構的形成。但當CaCl2濃度大到一定程度時，蛋白質發生過度凝聚造成網絡空隙增大。這也是造成凝膠細膩程度變差、得率和保水性下降的原因。

3 結論

(1)當處理壓力≥300 MPa、處理時間≥10 min、蛋白質質量濃度≥120 g/L時，WPI溶液經超高壓處理后才可以形成凝膠，且隨著處理壓力增大、處理時間延長和蛋白質濃度的提高，凝膠中的游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量明顯增加，凝膠網絡結構趨于致密，質地逐漸細膩，凝膠強度、得率和保水性呈現增大的趨勢；

(2)WPI溶液pH在等電點以上且接近中性時，形成的凝膠中二硫鍵含量高，凝膠網絡致密，凝膠強度、得率和保水性較高；在等電點附近及以下時，凝膠的特性和品質較差；

(3)添加CaCl2對形成凝膠中的二硫鍵含量不產生影響，但其可以通過鍵橋作用提高凝膠強度；凝膠得率與CaCl2濃度呈負相關；當CaCl2濃度為0.06 mol/L時，凝膠具有較大持水能力，之后保水性隨Ca2+濃度的升高而下降。