不同發酵處理對赤霞珠葡萄酒中氨基甲酸乙酯產量的影響

王根杰，李德美，張亞東，辛聞，王宗義

(北京農學院 食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京，102206)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)，是大多數發酵食品(如面包、牛奶等)和酒精飲料(啤酒、白酒、葡萄酒等)生產及貯存過程中產生的一種天然副產物[1]。經研究發現，EC在生物體內代謝時，被細胞色素P-450酶(cytochrome P-450，簡稱CYP)催化生成N-羥基-氨基-甲酸乙酯，后者誘導Cu2+調控的DNA損傷，引起DNA的氧化和脫嘌呤反應，使基因缺失或突變，這是EC致癌的主要原因[2-4]。2007年，國際癌癥研究機構將EC的致癌級別由之前的2B類提升認定為2A類。一些主要葡萄酒生產國也相繼制定了本國的葡萄酒中EC含量的限定標準。美國葡萄餐酒中的EC限量為15 μg/L，加拿大、韓國和捷克生產葡萄酒中的EC限量為30 μg/L。目前，我國仍未制定葡萄酒中EC的限量標準。近年來，隨著我國居民消費水平的提高，葡萄酒的消費量也日益上升，EC作為一種潛在的致癌物質已經逐漸引起了社會關注并成為了熱門研究對象，因此EC限量標準的制定勢在必行。

葡萄酒在釀造過程中，尿素與發酵產生的乙醇結合是產生EC的主要途徑。尿素的來源主要是酵母代謝氨基酸(主要是精氨酸)和葡萄園施氮肥。氮是釀酒酵母保持發酵能力和生物活性的重要營養元素，氮源的過高或過低都會影響葡萄酒的發酵狀態[5]。當發酵葡萄汁中酵母可利用氮(yeast assimiable nitrogen, YAN)含量低于140 mg/L時，會導致酒精發酵遲緩或者停滯[6]；當葡萄汁中的YAN含量在200～480 mg/L時，葡萄酒的酒精發酵處于比較理想的狀態[7]。在生產過程中，添加酵母助劑可保證發酵的順利進行，然而酵母助劑的用量對葡萄酒釀造過程中EC產量的影響研究很少。

本研究的目的是比較不同發酵處理對EC產量的影響，從而找到控制酒精發酵過程中EC含量的釀造工藝，服務于葡萄酒生產。同時，為我國葡萄酒中EC限量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)，2016年10月采收于河北懷來，成熟狀況、衛生條件良好。酒精發酵酵母ST、BO213、F15和酵母助劑THIAZOTE均購自法國LAFFORT公司；銨離子氮試劑盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure(96 Assays per kit)、氨基酸氮試劑盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure(100 Assays per kit)，愛爾蘭Megazyme International Ireland有限公司；甲醇、冰醋酸(色譜級)，美國Mreda公司；乙腈(色譜級)，韓國SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯標準品、氨基甲酸乙酯內標物(EC-d5)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

雙波長紫外分光光度計，北京Lab-Tech公司；Agilent 6410串聯液質儀，美國Agilent公司；Heal Force?Super Series NW超純水系統，上海Canrex分析儀器有限公司。

1.3 試驗設計

本試驗研究不同商業酵母在赤霞珠葡萄酒發酵過程中EC產量的差異性，選用ST、BO213、F15三種對氮源具有不同敏感度的酵母進行試驗，酵母接種量均為0.2 g/L。根據常規工藝設計，在葡萄酒發酵過程中添加0.2 g/L酵母助劑THIAZOTE。

同時本試驗進行不同用量酵母助劑的研究，在接種了0.2 g/L酵母F15(酒莊發酵赤霞珠葡萄酒相同的酵母)的發酵罐中分別添加了0、0.3、0.6 g/L的THIAZOTE酵母助劑，分別記為YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6個處理均設置3次重復，共18個獨立發酵單元，分別在發酵初期(比重1.090)、發酵中期(比重1.040)和發酵末期(比重1.000)取樣測定。

赤霞珠葡萄汁分析結果顯示含糖量233 g/L、酸度(酒石酸計)7.90 g/L、pH 3.22、葡萄汁初始比重為1.096。

葡萄原料→分選→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精發酵→分離→穩定與澄清處理→裝瓶

發酵前期溫度控制在20～22 ℃，每12 h進行1次壓帽操作；發酵中期溫度控制在25～28 ℃，每12 h進行2次壓帽操作；發酵后期溫度控制在22～25 ℃，不進行壓帽操作。

1.4 指標測定與方法

采收當天，根據標準[8]在相應葡萄地塊進行土樣的采集、處理和貯存，測定土壤中的銨態氮和硝態氮含量。葡萄采樣結束后，盡快送到實驗室進行壓榨與澄清處理，同時取葡萄汁樣品，貯存于-20 ℃低溫冰箱待測。

1.4.1 土壤中銨態氮和硝態氮含量的測定[9]

土壤中銨態氮含量的測定：采用氯化鉀浸提-靛藍比色法，計算公式如下：

(1)

式中：C,顯色液銨態氮的質量濃度，μg/kg；V,顯色液體積，mL；ts,分取倍數；m,土樣的質量，g。

土壤中硝態氮含量的測定：采用紫外分光光度法，計算公式如下：

(2)

式中：C,通過回歸方程算出的NO3-N含量；25,測定液的總體積，mL；D,稀釋倍數；m,鮮土樣質量，g。

1.4.2 葡萄汁中酵母可利用氮的測定[10]

采用試劑盒檢測氨基酸態氮和銨離子氮含量。計算公式如下：

(3)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(4)

式(3)中：X1,氨基酸態氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質量，g/mol；ε,氮素在波長340 nm處的消光系數；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

(5)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(6)

式(5)中：X2,銨離子氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質量，g/mol；ε,氮素在波長340 nm處的消光系數；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

可同化氮含量/(mg·L-1)=X1+X2

(7)

1.4.3 葡萄酒理化指標的測定[11]

根據國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

1.4.4 葡萄發酵液或葡萄酒中EC含量的測定[12]

本試驗利用EC-d5作內標進行測定，可以有效校正整個分析過程產生的誤差，使樣品處理更為簡易，降低了對人員熟練程度的要求[13]。

樣品前處理：將酒樣搖勻，立即準確取出1.00 mL于5 mL試管中，準確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內標工作液，旋渦振蕩5 s，吸取樣液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.4.4.1 液相色譜-質譜條件

XSELECT HSS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)，Zorbax Eclipse Plus-C18預柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)。柱溫為40 ℃，進樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min；流動相A為0.1%(V/V)乙酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫順序如表1所示。

電噴霧電離源正離子模式(ESI+)，多反應離子監測方式監測，MRM參數見表2。

干燥氮氣溫度為120 ℃，流速為10 L/min；霧化器壓力20 psi；噴霧毛細管電壓4 000 V。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The sequence of gradient elution

表2 MRM參數表Table 2 The parameter of multiple reaction monitoring

注：*為定量離子。

1.4.4.2 校正標準曲線和回歸方程

按照內標法測定EC含量得到的校正標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=7.919 7x+0.006，相關系數R2=0.999 3，方程線性較好，適合本試驗中EC的含量測定。

圖1 內標法測定EC的校正標準曲線Fig.1 The EC calibration standard curve

1.5 數據統計分析

采用SPSS 22.0進行數據處理與分析，對葡萄酒中的理化指標進行多重比較分析。利用Excel繪制酒精發酵過程中的EC產量變化圖。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄園土壤中氮含量及葡萄中YAN測定

氮是釀酒葡萄樹體和果實生長的主要營養素。土壤中的氮素可分為有機氮和無機氮，本試驗采集葡萄園土樣做含氮量測定，其中銨態氮含量為38.68 mg/kg, 硝態氮含量為20.46 mg/kg。土壤中銨態氮含量要高于硝態氮含量，根據河北省葡萄果園地力評價標準，該試驗地土壤中的氮處于較低水平[8]。

銨態氮是酵母可同化氮素的主要成分[10]，是釀酒酵母優先利用的無機氮源。土壤中的銨態氮水平會直接影響葡萄果實中的酵母可利用氮含量，經測定葡萄原料中的酵母可利用氮含量為188.53 mg/L。符合葡萄酒發酵所需最低140～150 mg N/L的要求[6]。

2.2 實驗葡萄酒理化指標檢測

酒精發酵結束后，葡萄酒經自然澄清后，與酒泥分離，經過穩定處理后裝瓶，2個月后取樣檢測葡萄酒的理化指標，結果如表3。

由表3可以看出，不同酵母和不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中理化指標含量均無明顯差異。葡萄酒主要理化指標正常，滿足酒精度≥7.0%，還原糖≤4 g/L和揮發酸≤1.2 g/L的要求[9]。葡萄酒發酵過程控制合理，符合干紅葡萄酒的發酵要求，保證了葡萄酒中EC含量的正常測定。

表3 赤霞珠葡萄酒理化指標Table 3 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon wine with different treatment

注：同列不同小寫字母表示p<0.05水平差異顯著。

2.3 不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產量的差異分析

精氨酸是葡萄汁中含量最豐富的氨基酸之一。在酒精發酵過程中，當發酵液中精氨酸含量過高時，會在酵母菌內代謝產生過量的尿素。酵母細胞內的尿素不會立即降解，使胞內的尿素含量積累過多，酵母菌的氮代謝受到抑制。酵母菌將過多的尿素由胞內釋放到發酵液中，尿素和發酵產生的乙醇結合生成EC。

發酵過程中不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒EC產量的差異性結果如圖2，結果顯示酵母ST、BO213和F15釀造的葡萄酒中EC產量存在差異。隨著發酵的進行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越來越少，酵母菌開始代謝精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代謝產生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒體中，與已積累的乙醇反應生成EC[14]。在發酵初、中期階段，3種酵母釀造葡萄酒均有少量的EC產生，而在不同酵母釀造的葡萄酒之間EC的產量具有差異。發酵末期，酵母BO213與ST、F15相比，釀造的葡萄酒中EC產量分別增長了45.0%和16.0%。這可能與不同酵母需氮量、氮代謝及尿素分泌能力有關。

a-發酵初期(1.090)；b-發酵中期(1.040)，此時添加酵母助劑；c-發酵末期(1.000)圖2 不同酵母處理不同發酵階段的EC產量Fig.2 Comparison of three different yeasts fermented on EC production during fermentation

2.4 不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產量的差異

在酒精發酵過程中，酵母進行生長繁殖和代謝，會逐漸消耗葡萄汁中的氮源物質。當發酵液中氮源物質缺乏時，會延緩發酵甚至停滯。酵母助劑的成分主要是(NH4)2HPO4，可以補充酵母所需氮源，加快發酵速率。而過量的(NH4)2HPO4會使酵母代謝過剩，從而產生EC。

本試驗酒精發酵過程中，不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產量差異性如圖3。在發酵中期添加酵母助劑后，不同用量酵母助劑處理釀造的葡萄酒中EC產量與發酵前期相比均有增長，且YN0.3、YN0.6均比對照組YNCK釀造的葡萄酒中EC產量高。與發酵中期相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在發酵末期的EC產量分別增長了37.5%、38.0%、33.3%，表明酵母助劑的使用有提高EC產量的風險。而在發酵末期，不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中EC產量差異顯著，與YNCK相比，YN0.3和YN0.6釀造的葡萄酒中EC產量分別增加了25.5%和45.5%，結果顯示，酵母助劑用量增加所釀造的葡萄酒中EC產量越大。

a-發酵初期(1.090)；b-發酵中期(1.040)，此時添加酵母助劑；c-發酵末期(1.000)圖3 酵母助劑不同用量處理不同發酵階段EC產量Fig.3 Comparison of three different yeast nutrients used on EC production during fermentation

2.5 不同處理獲得的赤霞珠葡萄酒中EC含量結果分析

葡萄酒發酵結束后，經過澄清、過濾、裝瓶，置于瓶儲室(溫度在15～20 ℃，空氣相對濕度在65%～70%)儲存。裝瓶2個月后取樣，測定各處理獲得的赤霞珠葡萄酒中的EC含量如表4。

表4 赤霞珠葡萄酒中的EC含量 單位：μg/LTable 4 EC content in Cabernet Sauvignon wine

由表4可以看出，不同處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC含量均較低，都遠低于美國或歐盟限定標準[15]。

3 結論與討論

本試驗主要研究不同發酵處理對赤霞珠葡萄酒中EC產量的影響，選擇不同酵母和不同用量酵母助劑發酵進行研究。試驗結果表明，在葡萄酒發酵過程中，不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產量差異顯著，就選擇的3種酵母而言，酵母BO213的EC產量多于酵母F15和ST。在選擇酵母F15的前提下，發酵過程中使用酵母助劑用量多的赤霞珠葡萄酒中EC產量較高，產量高低順序為YN0.6>YN0.3>YNCK。發酵過程中，赤霞珠葡萄酒中EC產量的變化趨勢為，發酵初期階段和發酵中期階段產生較少，發酵后期階段EC產量較多。

在整個實驗過程中，測定的赤霞珠葡萄酒中的EC含量范圍為1.9～8.0 μg/L，均未超過美國或歐盟限量水平[15]。在實驗葡萄園現有的土壤氮素營養水平下，使用酵母ST(接種量為0.2 g/L)或使用酵母F15(接種量為0.2 g/L)且不添加酵母助劑，可以使赤霞珠葡萄酒發酵順利進行，釀造的葡萄酒中EC的產量符合美國或歐盟的限量標準，同時可以使葡萄酒中的EC產量保持在較低水平。