鯰魚皮明膠的功能性質分析

李從虎，孫秀芳，王慧婷，張笑笑，周穎，吳彥*

1(安慶師范大學 生命科學學院，安徽 安慶，246133) 2(皖西南生物多樣性研究與保護安徽省重點實驗室，安徽 安慶， 246133) 3(水生生物保護與水生態修復安徽省高等學校工程技術研究中心，安徽 安慶，246133)

明膠是一種從動物的皮、骨、腱等含膠原蛋白的組織中經過一系列化學處理以后部分水解的高分子蛋白質[1]。因其具有優良的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等特性，而廣泛應用于生物醫藥、組織工程和食品等領域。明膠除了具有水合作用外，還具有其他兩類重要的性質：(1)凝膠化作用，如組織化和水結合能力；(2)表面性質，如泡沫性、乳化性、吸附性和成膜性[2]。

目前，明膠產品多來源于豬皮和牛皮。由于受口蹄疫和瘋牛病等人畜共患病以及一些宗教信仰的影響，這一原料來源的明膠產品飽受爭議[3]。魚類副產物2014年在世界范圍內的產量高達5 000萬t[4]，因此，利用這類下腳料生產明膠成為哺乳動物明膠原料來源的有效替代者，且魚類明膠的提取技術已日趨成熟。ABDELMALEK等[5]從烏賊皮中提取明膠，其提取率達到6.82 g/100g(濕重)。在食品領域，明膠的應用仍基于其優良的功能性質。例如，NHARI等[6]將明膠添加到酸奶酪中，用以增強酸奶酪的粘稠性而降低其脫水縮合作用。此外，明膠的泡沫性可用于冰激凌中，乳化性也可適用于肉類產品中[7]。可見，基于明膠功能性質的研究對于其應用具有重要的指導意義。

鯰魚(Mystusmacropterus)是我國養殖的主要淡水魚種類之一，廣泛分布于我國江河湖泊，尤以長江、錢塘江流域居多。依據中國漁業統計年鑒數據顯示，2015年鯰魚產量達45萬t。鯰魚肉質鮮美，富含蛋白質、氨基酸、脂肪等營養物質，但其加工過程中會產生大量的魚皮、魚骨等副產物，約占魚體總重的50%[8]。在鯰魚加工副產物中，其皮膚組織富含大量膠原蛋白，可繼續加工利用，不僅降低人畜共患病的風險，也促進了鯰魚皮廢棄物的資源化利用和人類的可持續發展。因此，本文以鯰魚皮為原料，提取出明膠，研究其持水性、泡沫活性和穩定性以及不同條件下的乳化活性和穩定性，以期為其工業應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮鯰魚(Mystusmacropterus),購于安慶本地農貿市場(2017年4～7月)，原料獲取后去除雜質，將魚皮組織置于冰箱中冷凍保存；植物油由中糧集團提供；HCl、NaOH等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SJIA-10N型冷凍干燥機(寧波雙嘉儀器有限公司)；PHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠)；SC-3612型離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；HHS-8S型電熱恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)； 78HW-1型磁力攪拌器(上海皓莊儀器有限公司)； 752可見-紫外分光光度計(上海精科實驗有限公司)；組織搗碎機(金壇友聯儀器研究所)；BX51光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 明膠提取

草魚皮明膠提取參照文獻[5]的方式進行。

1.3.2 明膠的持水性分析

明膠的持水性參照CHO等[9]介紹的方法來測定。取1只精確稱重的離心管，放入1.0 g凍干的明膠和10.0 g去離子水。隨后樣品在20 ℃下每隔15 min劇烈攪拌5 s，總時間為1 h，然后將樣品以5 000×g的速度離心20 min。棄去上清液，并將離心管傾斜45°放至于濾紙上30 min。最后稱取總質量，得到結合水的質量，從而計算出明膠的持水性(以冷凍凍干的明膠計)。通過改變溶劑的離子強度(NaCl，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol/L)考察離子強度對明膠持水性的影響。

1.3.3 明膠的起泡性分析

明膠的起泡性分析參照文獻[10]的方法進行。將明膠溶解于去離子水中得到質量濃度為10、20、30、40和50 g/L的溶液，靜置20 min后，置于勻漿器中高速攪拌(10 000 r/min)10 min使其產生氣泡。隨后，迅速將樣品移入100 mL量筒中，分別記錄0、5、10、20、30 min后液體和氣泡的總體積。泡沫活性(FE)和泡沫穩定性(FS)按以下公式計算：

(1)

(2)

式中：FE,泡沫活性，%；FS，泡沫穩定性，%；VT和Vt分別為0和t min氣泡總體積，mL；V0，產生氣泡前的總體積，mL。

1.3.4 明膠乳液類型鑒別

參照文獻[11]，將冷凍干燥的明膠溶解于去離子水中得到10 g/L的明膠溶液，取50 mL溶液與5 mL植物油混合均勻并在勻漿器中高速攪拌(10 000 r/min)10 min，得到明膠乳液。取一滴亞甲基藍溶液(1 g/L)于乳液(10 mL)樣品中，置于漩渦振蕩器中振蕩10 s，靜置3 min后觀察乳狀液的顏色，以鑒別乳液的類型。

1.3.5 明膠乳液的顯微形態

參照文獻[5]，按上述方法制備明膠乳液，將其稀釋后，取一滴于載玻片上，并蓋上蓋玻片，靜置5 min后用光學顯微鏡觀察樣品的顯微形態。

1.3.6 明膠的乳化力分析

乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)作為間接測定乳液粒子大小的指數，可以通過濁度法測定[10]。將樣品乳液制備好后分別在0 min和10 min吸取乳液用1 g/L 十二烷基磺酸鈉(SDS)稀釋并用漩渦振蕩器振蕩10 s。最后用紫外-可見分光光度計在500 nm下測定稀釋液的吸光度。EAI和ESI可由公式(3)和(4)計算得到：

(3)

(4)

式中：EAI，乳化活性，m2/g；ESI，乳化穩定性，min；A，500 nm下的吸光度；l，比色皿直徑，m；DF，稀釋倍數；φ，植物油所占比例，%；C，明膠質量濃度，g/m3；A0，初始吸光度值；ΔA=A0-A10；Δt=10 min。

考察明膠乳化力時，基本條件設置為：明膠質量濃度10 g/L，pH 7.0，溫度20 ℃，離子強度為0。改變其中一個條件，固定其它條件以確定不同環境條件對草魚皮明膠乳化力的影響。其中，質量濃度：10、20、30、40、50 g/L；pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；離子強度：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L；溫度：20、25、30、35、40、45、50 ℃。

1.3.7 數據分析與處理

2 結果與分析

2.1 明膠的持水性分析

蛋白質與水的相互作用通常包括3個方面，即蛋白質最內層緊密作用的結合水、依靠氫鍵等作用于蛋白質表面的不可凍結水和依靠物理溶脹截留的自由水[12]。將蛋白質與液態水直接作用，通過其自身的溶脹、黏度增加和形成凝膠等一系列物理化學反應所吸收的水分稱為持水性。蛋白質的持水能力可以達到改善產品質量、提高產品得率的目的。圖1所示為離子強度對明膠持水性的影響。由圖1可知，當離子強度由0增加到0.2 mol/L時，持水性逐漸提高，0.2 mol/L時，明膠的持水性最大，達到6.5 g/g；當離子強度增加至0.8 mol/L，明膠持水性顯著降低；繼續增加離子強度，持水性降低逐漸趨于平緩。這是因為在低離子強度時，離子并未破壞明膠的水化層，反而增加了明膠的溶解性，促進了明膠與水分子的相互作用；而當離子強度超過0.2 mol/L時，鹽離子與蛋白質競爭水分子，破壞了蛋白質的水化層和雙電層，使得蛋白質脫水并降低其持水性；當離子強度大于0.8 mol/L，因鹽離子競爭了大部分水分，導致明膠持水性降低緩慢[13]。

圖1 離子強度對明膠持水性的影響Fig.1 Effect of ionic strength on the water binding capacity of gelatin

2.2 明膠的起泡性分析

圖2為以吐溫80為對照的鯰魚皮明膠的泡沫活性和泡沫穩定性。

圖2 鯰魚皮明膠、吐溫80的泡沫活性和泡沫穩定性Fig.2 Foam expansion (FE) and foam stability (FS) of catfish skin gelatin and tween 80

當鯰魚皮明膠質量濃度由10 g/L增加到50 g/L，其泡沫活性由127.66%增加至151.23%，且隨著時間的延長，明膠的泡沫活性和穩定性逐步降低。這一趨勢與烏賊皮明膠[5]、星鯊明膠[14]和觸須魚明膠[15]相同。早在1983年，TOWNSEND和NAKKAI[16]就報道了增加蛋白質的疏水性可以增強食品蛋白質的泡沫活性和泡沫穩定性。隨著明膠質量濃度的增加，明膠分子的疏水區域增多、黏度增大，從而促進了其在氣液界面形成緊密結合的多層膜，并最終導致泡沫活性和穩定性的增強[5]。隨著時間的延長，在重力作用下，氣泡間易發生擴散并最終破裂，導致所測試濃度范圍內，明膠的泡沫穩定性逐漸降低[10]。吐溫80的泡沫活性和穩定性的趨勢與鯰魚皮明膠相同，但遠遠高于鯰魚皮明膠。與傳統的表面活性劑吐溫80相比，鯰魚皮明膠是一種親水性蛋白質，且分子量較大導致分子面積的增大和泡沫表面的內聚力減少，從而使其泡沫活性和穩定性較差[17]。

2.3 明膠乳液類型的鑒別

乳液一般分為水包油型(O/W)和油包水型(W/O),可通過染色法進行鑒別。將極微量的水溶性染料滴入到乳液中，如果整個乳液帶有染料顏色則為O/W型乳液，若用油溶性染料結果則恰好相反。常用的油溶性染料有紅色的蘇丹Ⅲ等，水溶性染料則有熒光紅、亞甲基藍等。以水溶性染料亞甲基藍染色乳液的方法鑒別明膠和吐溫80乳液的類型。根據外觀可知，2種乳液都呈現水溶性染料亞甲基藍的顏色，因此判斷2種乳液均為O/W型乳液。

2.4 明膠乳液的顯微形態

圖3為明膠乳液在光學顯微鏡下的形態。對比吐溫80發現，明膠乳液中僅有小部分液滴的直徑較大，這是因為鯰魚皮明膠的親水性以及分子量較大，使其吸附于油滴界面的能力較弱且數量較少[18]。然而，絕大多數鯰魚皮明膠乳液的數量和大小與吐溫80乳液相當，表明了鯰魚皮明膠在食品領域中可用作乳化劑的潛力。

a-吐溫80;b-明膠圖3 吐溫80和明膠乳液在高倍鏡下的顯微形態Fig.3 Micro-morphology of emulsions for tween 80 and gelatin

2.5 明膠的乳化力分析

2.5.1 明膠濃度對其乳化力的影響

圖4為不同濃度明膠溶液對其乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)的影響。由圖可知，隨著明膠溶液質量濃度的增加，乳化活性逐漸增大，而乳化穩定性卻呈下降的趨勢。雖然有文獻[19]報道從金槍魚魚鰭提取出的明膠的乳化活性和穩定性隨著明膠濃度的增加一直呈現增加的趨勢，但也有報道烏賊皮明膠的乳化活性隨濃度增加而增加，而乳化穩定性卻逐漸下降[5]。隨著鯰魚皮明膠濃度的增加，其與油滴界面接觸的數量增多，從而導致乳化活性增強；但濃度增加，明膠分子之間易聚集，使得乳液液滴粒子不斷增大，而且明膠分子與油滴界面之間的疏水作用的平衡也會隨其濃度的增大而破壞，導致鯰魚皮明膠的乳化穩定性反而下降[20]。

2.5.2 pH值對明膠乳化力的影響

圖5為鯰魚皮明膠溶液在不同pH值下的乳化活性和乳化穩定性。由圖5可見，隨著pH值的升高，明膠的乳化活性和乳化穩定性降低，在pH 5.0時達到最低，隨后乳化活性和乳化穩定性則隨著pH值的升高而繼續升高。pH 5.0時，明膠溶液的乳化活性和乳化穩定性最小，分別為27.45 m2/g和39.54 min。有文獻報道當溶液的pH值遠離蛋白質的等電點時，其溶解性和電子排斥力增大，因而能夠促進蛋白質樣品的乳化活性和乳化穩定性[21-22]。已經測定本方法提取的鯰魚皮明膠的等電點為4.89，接近5.0，明膠在此時的溶解性和電子排斥力最低，聚集形成直徑較大的聚集體，由此導致其乳化活性和乳化穩定性下降到最低值。

圖5 pH值對明膠乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the emulsion activity index and emulsion stability index of gelatin

2.5.3 離子強度對明膠乳化力的影響

離子強度對鯰魚皮明膠乳化活性和乳化穩定性的影響如圖6所示。從圖6中可以很明顯的看出，當NaCl濃度增加至0.2 mol/L時，明膠的乳化活性逐漸增加，繼續增加離子強度時，明膠的乳化活性卻顯著下降；而在所測試的離子強度范圍內，明膠的乳化穩定性卻呈不斷降低的趨勢。這一現象與烏賊皮明膠[21]以及鷹嘴豆蛋白提取液[22]的乳化力相符合。低離子強度下(<0.2 mol/L)，鹽溶效應提升了明膠的溶解性，促進了明膠分子與油滴之間的相互作用，從而使明膠乳化活性增加，而Na+可能結合到明膠分子中，導致明膠的乳化穩定性呈下降趨勢[22]。當離子強度大于0.2 mol/L時，鹽析效應，使明膠乳液粒徑不斷增大，導致乳化活性和乳化穩定性逐漸降低[23]。此外，AEWSIRI等[21]研究NaCl對明膠乳化力的影響時，認為NaCl的存在使得乳液液滴之間的排斥力不能有效克服液滴之間的吸引力(如范德華力和疏水作用)，這種電子篩選使得乳液的凈電荷降低并最終導致明膠的乳化活性和乳化穩定性的降低。

圖6 離子強度對明膠乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.6 Effect of ionic strength on the emulsion activity index and emulsion stability index of gelatin

2.5.4 溫度對明膠乳化力的影響

溫度對鯰魚皮明膠乳化活性和穩定性的影響如圖7所示。當溫度從20 ℃升高到30 ℃時，明膠的乳化活性和乳化穩定性緩慢上升，隨著溫度的繼續升高，其乳化活性和乳化穩定性呈現降低的趨勢。當溫度低于30 ℃時，可以促進埋藏在明膠分子內部的疏水區域的展開[22]，增強蛋白質分子與油滴之間的相互作用，從而導致明膠的乳化活性和乳化穩定性的升高。然而當溫度高于30 ℃時，明膠分子從乳液液滴表面的解吸附作用使得乳液液滴破裂和不穩定[24]。此外，溫度升高，乳液液滴的運動增強，容易相互碰撞形成顆粒較大的液滴，導致明膠的乳化活性和乳化穩定性降低。

圖7 溫度對明膠乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the emulsion activity index and emulsion stability index of gelatin

3 結論

明膠的持水性、起泡性和乳化性在食品領域中具有重要的應用。研究結果表明，鯰魚皮明膠在低離子強度下具有良好的持水性；其乳液呈O/W型，乳化力與吐溫80相當，但起泡性相對較差。當明膠質量濃度為50 g/L和離子強度為0.2 mol/L時，其乳化活性提升，但卻在10 g/L明膠質量濃度和較低離子強度具有較強的穩定性。此外，在等電點附近和高溫條件下，明膠的乳化活性和穩定性顯著降低。實驗結果表明鯰魚皮明膠具有食品工業應用的潛力，今后可通過修飾提升其性能，進一步擴大應用范圍。