枯草芽孢桿菌菌株B3抗菌肽的分離純化與鑒定

白杰，贠建民*，祝發明，嚴海嬌，張紊瑋，艾對元

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省生物抗菌肽工程技術研究中心，甘肅 張掖，734000)

抗菌肽(antibacterial peptides)又稱抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)，是生物體在抵抗病原微生物的防御反應過程中產生的一類具有抗微生物活性的小分子多肽。目前，在不同動、植物組織和微生物中都已經被發現，并被證實有抗菌作用的蛋白質和多肽也是其先天免疫系統中重要的組成部分[1]。這些抗菌肽具有抗菌能力強、抗菌譜廣、種類多、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產生抗性突變等特點，同時鑒于許多微生物已對抗生素產生抗藥性，因此，抗菌肽預計將成為新一代的臨床抗菌藥物，并且在化妝品、生物農藥、動物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物抗病基因工程等方面具有廣闊的應用前景[2-3]。

自1972年，瑞典的科學家BOMAN等人首先在果蠅中發現抗菌肽及其免疫功能方面的活性以來，直到1981年《Nature》雜志上公布的來自STEINER等人發現的CecropinA、B的氨基酸序列被認為是第一個真正意義上的抗菌肽[4]。在此后多年時間里，人們相繼從微生物和動植物甚至人體內發現、分離獲得了多種具有抗菌能力的活性多肽。BAGHIAN等研究發現，用與蜂毒素類似的合成物與疙疹病毒(HSV-1)作用時，能抑制HSV-1感染細胞的破裂和病毒擴散，蜂毒素的存在不僅能夠影響糖蛋白的合成，還可通過調整細胞Na+/K+泵而保護細胞從而阻止了細胞的裂解，因而對宿主細胞的蛋白質合成和生長不會產生影響[5-6]。STEIN發現枯草芽孢桿菌(B.subtilis)具有產生二十多種結構多樣化抗菌化合物的潛力[7]，在這些抗微生物化合物中，表面活性素和神經蛋白的環狀脂肽等在生物技術和生物制藥應用中具有廣泛認可的潛在用途[8-9]。迄今為止，已發現的Cereopin A，Myfimycin，Thanafin和Drosomycin等生物活性小肽都具有抗真菌的作用[10-11]。近年來，張東玲等人在研究針對單一抗菌肽用不同層析柱分離純化中發現凝膠過濾層析柱與反相液相層析柱的聯用改善日本鰻鱺肝臟抗菌肽分離純化效果良好，洗脫峰數量較多，峰形單一且尖銳狹窄，基線平而低[12]。喻鋼等人建立了基于制備型反相色譜柱分離純化枯草芽孢桿菌細菌素類抗菌活性物質方法[13]。目前抗菌肽的分離純化方案大多是基于抗菌肽分子量較小、帶正電荷和兩親性等特性，采用多級純化手段[14]。盡管抗菌肽具有巨大開發潛力，但對其結構信息與活性功能之間的關系還不甚了解[15]，建立高效的抗菌肽分離、純化和檢測方法是開展相關理論研究和應用開發的基礎。

本研究以枯草芽孢桿菌B3菌株液態發酵產物為樣品，擬采用串聯層析系統，通過由陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析3種層析組成的層析系統，根據發酵液中目的抗菌肽與雜蛋白具有電荷差異、疏水差異、分子大小差異的原理，分別去除其他物質從而達到純化的效果。并將經串聯層析系統和反向色譜技術純化后的抗菌肽，通過MALDI-TOF-MS質譜分析對得到具有抑菌活性的小分子多肽進行分子質量及結構信息分析，旨在為獲得抗菌肽純品及其結構信息，并為抗菌肽制備及抗菌肽制品檢測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 靶標菌株

大腸桿菌(CGMCC10003)和沙門氏桿菌(CGMCC10467)，由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 拮抗菌株

本實驗室前期從甘肅河西鹽堿土壤中分離獲得1株對大腸桿菌(Escherichiacoli)和沙門氏桿菌(Salmonellaentericasubsp.enterica)具有拮抗作用的細菌菌株B3，經鑒定為枯草芽孢桿菌B3(BacillussubtilisB3)。

1.1.3 培養基

LB液體培養基、LB固體培養基：參考《分子克隆實驗指南》中培養基配方配制。

1.1.4 試劑

Capto S離子交換層析介質，GE Healthcare有限公司；苯基-瓊脂糖凝膠，北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-100凝膠柱，上海玉博生物科技有限公司(Pharmacia)；氨芐青霉素，上海莼試生物技術有限公司；NaCl、KH2PO4、K2HPO4，天津市盛奧化學試劑有限公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉，北京蘭博利德商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

HL-2恒流泵，上海精科實業有限公司；離心機，德國Sigma實驗室離心機股份有限公司； DHP-9012電熱恒溫培養箱，上海立久自動化設備有限公司；潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；101型鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器有限公司；冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；反向高效液相色譜儀(WATERS 2695型)、反射式基質輔助激光解吸附飛行時間串聯質譜( USA ABI-4800型)、UV-5800PC紫外分光光度計，上海華錫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌粗提物的制備

從甘肅河西鹽堿土壤中發現1株對大腸桿菌(E.coli)和沙門氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)具有抑菌作用的枯草芽孢桿菌B3菌株(BacillussubtilisB3)，將該枯草芽孢桿菌B3菌株接種到LB液體培養基中，于37 ℃、250 r/min振蕩培養48 h，11 000 r/min離心20 min收集上清液，得到的上清液即為抗菌粗提物。

1.3.2 抗菌活性物質的分離純化

1.3.2.1 陽離子交換層析

采用Capto S陽離子柱對上述抗菌粗提物進行層析。用0.02 mol/L, pH 5.8的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將抗菌粗提物以2 BV/h的速度上樣，隨后以0.03～0.12 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，每5 min收集1次洗脫液，分別用紫外分光光度計在波長280 nm處測其吸光度，繪制吸光值曲線圖[16]，并采用1.3.5方法進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線圖[17]。

1.3.2.2 疏水層析

以苯基-瓊脂糖凝膠作為疏水介質對上述1.3.2.1收集的洗脫液進行疏水層析，其中采用0.02 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2 BV/h的速度上樣，隨后依次用0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mol/L的pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，每5 min收集1次洗脫液，繪制吸光度曲線，評價分離效果，并進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線圖[18-19]。

1.3.2.3 尺寸排阻層析

以Sephadex G-100凝膠柱對有抑菌活性的組分進行純化，其中采用0.02mol/L，pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2 BV/h的速度上樣，隨后以pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，每5 min收集1次洗脫液，繪制吸光度曲線，評價分離效果，并進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線圖[20]。

將上述逐步層析后的具有抑菌活性的洗脫液，進行冷凍干燥，得到的即為抗菌肽，-20 ℃保存，備用。

1.3.3 反相HPLC分離純化抗菌物質[21-22]

①樣品處理: 將經過串聯層析系統純化后的半純品溶于雙蒸水中，溶液濃度為300 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾備用。②色譜條件：ZORBAX 300 StableBond (300SB) C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 流動相A：0.1%的三氟乙酸水溶液；流動相B：80%的乙腈水溶液；柱溫：25 ℃，檢測波長：280 nm；最大壓力：200 bar；時間：65 min；流速：0.700 mL/min；上樣量：20 μg。收集各個峰樣品，冷凍干燥。以沙門氏菌作為指示菌，進行抑菌實驗檢測各個峰的活性。

1.3.4 B3抗菌物質的基質輔助激光解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS分)析

收集反相HPLC分離純化得到的活性峰，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)質譜分析，NCBI數據庫檢索和比對。質譜檢測條件：鞘氣體流量15 arb，輔助氣體流量5 arb，熱噴涂電壓4.7 kV，毛細管溫度 275 ℃，毛細管電壓49 V，套管透鏡補償電壓 120 V。

1.3.5 抑菌活性檢測[23]

采用雙層瓊脂孔穴擴散法并稍作改動。以大腸桿菌(CGMCC10003)和沙門氏桿菌(CGMCC10467)為靶標菌。將大腸桿菌和沙門氏桿菌分別接種至LB液體培養基與營養肉湯培養基，于37 ℃振蕩培養15 h，備用。將加熱融化的LB固體培養基15 mL注入到無菌平皿中待凝固后形成底層并放置牛津杯，吸取靶標菌液各100 μL，分別加入裝有未凝固且不燙手的LB固體培養基三角瓶中，混勻，傾注30 mL到平皿中待凝固后形成上層，凝固后取出牛津杯形成有孔穴的培養平板，然后在培養基已形成的孔洞里加入200 μL的待檢樣液，并做陰性、陽性對照。其中陰性對照為緩沖液，陽性對照為質量濃度100 μg/mL的氨芐青霉素溶液。置于37 ℃培養箱內培養15 h，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。試驗重復3次，計算平均值。

1.3.6 抗菌肽的理化性質

1.3.6.1 最小抑菌質量濃度測定

將定量由上述方法純化后的樣品做2倍遞減質量濃度稀釋，分別為0.010 156、0.020 312、0.040 625、0.081 25、0.162 5、0.325、0.65、1.3 μg/mL，對2株靶標菌分別做抑菌試驗，以抑菌圈直徑在10 mm以上作為依據來確定最小抑菌質量濃度。試驗重復3次，計算平均值[24]。

1.3.6.2 耐熱性檢測

將定量由上述方法純化后的樣品配成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在40、50、60、80、90、100、110、120 ℃下分別加熱30 min，對2株靶標菌分別做抑菌試驗，以未經加熱的純化樣品為對照，觀察抑菌圈直徑變化[25]。試驗重復3次，計算平均值。

1.3.6.3 耐酸堿度檢測

將定量由上述方法純化后的樣品配成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液，分別調pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，放置10 min，對大腸桿菌及沙門氏桿菌做抑菌實驗，觀察抑菌圈直徑變化，以pH 5.8的純化樣品為對照[26-27]。試驗重復3次，計算平均值。

1.3.6.4 光照穩定性檢測

將定量由上述方法純化后的樣品配成質量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，在日光燈下放置10 min、30 min、1 h、6 h、24 h、48 h，對大腸桿菌及沙門氏桿菌做抑菌實驗，觀察抑菌圈直徑變化，以未經日光燈照射的純化樣品為對照。試驗重復3次，計算平均值。

2 結果與分析

2.1 串聯柱層析系統分離結果

2.1.1 離子交換層析結果

抗菌肽通常為具有陽離子特性的多肽[28]。陽離子交換層析是利用離子交換劑(即交換介質)上的可交換離子與周圍介質中被分離的各種離子間的親和力不同，即利用離子交換劑的荷電基團，吸附樣品溶液中相反電荷的離子或離子化合物，被吸附的物質隨后被帶同類型電荷的其他離子所置換而被洗脫，由于各種不同的離子或離子化合物對離子交換劑的結合力不同，因而洗脫的速率不同形成了層析層從而達到分離的目的。本試驗采用Capto S柱，首先對發酵液進行了層析分離，結果見圖1。

圖1 離子交換層析分離效果Fig.1 Separation effect of ion exchange chromatography

在Copto S離子交換色譜圖1中可以看出，各色譜峰之間分離效果還較差，色譜峰信號較弱。但實驗證明了該抗菌肽具有陽離子交換特性，屬于陽離子肽或具有陽離子特性的多肽。

發酵液經Capto S層析后，洗脫共收集30管樣品，做抑菌實驗發現第8管前后的收集液有抗菌活性，將有活性管合并，再用疏水層析柱層析。

2.1.2 疏水層析結果

疏水層析是利用多肽/蛋白質的疏水基團與親水基團進行分離，多肽/蛋白質的表面通常具有疏水性基團，其與層析介質中帶有疏水性的載體在高鹽濃度時會結合，離子強度(鹽濃度)越高，結合所形成的疏水鍵越強，由于形成的結合力不同從而達到分離的目的。本試驗采用苯基-瓊脂糖凝膠作為疏水介質，對2.1.1中收集到的抑菌活性部分進行分離，結果見圖2。

圖2 疏水層析分離效果Fig.2 Separation effect of hydrophobic chromatography

圖2顯示，經過疏水層析后，其色譜峰分離效果較離子交換層析有所提高，但各蛋白質峰仍然相互重疊，不能被完全分開。對分步收集樣品做抑菌活性試驗，發現第7管有1個明顯的色譜峰，且該時間段的樣品有抑菌活性。

2.1.3 尺寸排阻層析結果

尺寸排阻層析是基于分子的大小不同進行分離，是一種非吸附形式的層析方法，因此緩沖液的成分不會直接影響分離結果，目的抗菌肽可以在廣泛的pH值及離子強度下進行物質的分離。本試驗采用葡聚糖凝膠G-100作為填料對上述收集的活性洗脫液進行尺寸排阻層析，結果見圖3。

圖3 尺寸排阻分離效果Fig.3 Separation effect of size exclusion

圖3顯示，樣品色譜峰分離效果較疏水層析有所提高，有明顯的優勢峰，抑菌活性試驗發現第16管有抑菌活性，收集活性組分，冷凍干燥備用。

2.1.4 分步層析分離物的抑菌活性比較

以質量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素溶液為陽性對照，緩沖液為陰性對照，開展了分步串聯層析不同層析柱收集液對E.coli和S.entericasubsp.enterica抑菌試驗比較，結果見圖4和表1。對于2株供試靶標菌而言，氨芐青霉素陽性對照均具有明顯抑菌圈，而陰性對照蒸餾水則無抑菌圈。在串聯柱層析系統中，3種層析均收集到了能夠抑制2株供試靶標菌的活性組分，陽離子交換層析活性相對弱于疏水層析和尺寸排阻層析收集到組分的抑菌活性，而經過疏水層析收集到組分的活性又相對弱于尺寸排阻層析收集到組分的活性。即抑菌活性(抑菌圈)大小順序為：陽離子交換層析<疏水層析<尺寸排阻層析。

a-靶標菌為大腸桿菌；b-靶標菌為沙門氏桿菌圖4 串聯柱層析收集液抑菌實驗Fig.4 Antibacterial activity of tandem column chromatography

表1 串聯柱層析收集液抑菌直徑Table 1 The antibacterial diameter of the column chromatography

注：“-”表示無活性；CK為0.02 mol/L、pH 5.8 PBS緩沖液；陽性對照為：100 μg/mL的氨芐青霉素溶液;不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.2 反相HPLC分離純化抗菌物質

按照1.3.3所述的色譜條件進行反相 HPLC分離純化，收集每峰共19個樣品，冷凍干燥。以沙門氏菌作為指示菌，進行抑菌試驗檢測每個樣品的活性。結果表明:第8峰樣品組分具有明顯的抑菌效果，結果見圖5和表2。

圖5 半純品的高效液相色譜檢測結果Fig.5 Semi-pure liquid with high performance liquid chromatography

表2 RP-HPLC色譜各洗脫峰抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of elution fractions purification from RP-HPLC chromatography

注：“-”表示無活性；CK為0.02 mol/L、pH 5.8 PBS緩沖液。

2.3 質譜分析抗菌肽氨基酸序列

經反相HPLC分離后抗菌活性組分進行MALDI-TOF-MS分析(圖6)得到該抗菌肽的氨基酸序列為：Pro-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu，是一種富脯氨酸抗菌肽。由ExPasy中的ProtParam軟件計算得到其分子質量為1 567.86 Da，等電點為10.84。將該肽段的氨基酸序列利用NCBI做同源性分析[29]，與之序列相似性最高的僅為44.3 %，發現其為一種未報道的多肽，結果未發現有與之序列相匹配的蛋白質，可以證明本研究分離純化到的B.subtitesB3抗菌肽很可能是一個新的蛋白質。

圖6 質譜分析譜圖Fig.6 Tandem mass spectrometry

2.4 最小抑菌濃度測定

由表3可知，該抗菌肽對E.coli和S.entericasubsp.enterica都有抑菌效果，且在濃度較低時依然保持穩定的活性，對2種靶標菌的最小抑菌質量濃度均為0.020 312 μg/mL。

表3 抗菌肽的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of antimicrobial peptides

注：—無抑菌效果。

2.5 耐熱性檢測

由圖7可知抗菌肽在40～100 ℃加熱后對E.coli和S.entericasubsp.enterica的抑菌活性變化不大，在100 ℃以下沒有顯著的變化，而在110 ℃抑菌活性出現下降，在121 ℃加熱后喪失抑菌活性，可見抗菌肽在110 ℃以下具有較好的耐熱性。

圖7 不同溫度加熱對抗菌肽抑菌活性的影響Fig.7 Effects of different temperature heating on antimicr-obial activity of antibacterial peptides注：豎線表示標準誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.6 耐酸堿度檢測

由圖8可知抗菌肽在pH 4～11時具有較穩定的抑菌活性，當pH超過11后抑菌活性明顯受到影響，可見，該抗菌肽對酸、堿度具有較好的穩定性。

圖8 不同pH對抗菌肽抑菌活性的影響Fig.8 Effects of different pH on antimicrobial activity of antibacterial peptides注：豎線表示標準誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.7 光照穩定性檢測

由圖9可知該抗菌肽在光照射時長10 min～48 h處理后對E.coli和S.entericasubsp.enterica的抑菌活性沒有變化，可見該抗菌肽對光照具有較好的穩定性。

圖9 不同光照時長對抗菌肽抑菌活性的影響Fig.9 Effect of different illumination time on antimicrobial activity of antibacterial peptides(注：豎線表示標準誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。)

3 討論

枯草桿菌具有良好的分泌性和非致病性等生物學特點，從枯草芽孢桿菌中提取抗菌肽具有廣闊的開發前景[30]。徐建研究了表達PBD-2和cecropin P1抗菌肽的枯草芽孢桿菌，其所得的抗菌肽活性穩定，對多種革蘭氏陰性菌，特別是腸桿菌科(Enterobacterhormaeche和Edwards)細菌，具有很強的傷殺作用，而對包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在內的革蘭氏陽性菌不起作用，并且對真核細胞沒有毒性作用[31]；莊國宏等人研究了1株能產生對大腸桿菌(E.coli)具有明顯抑殺作用抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株，其所得的抗菌肽具有抑菌譜較廣、性質穩定的特點，在初步機理的研究中還發現該菌能夠引起腸桿菌細胞膜穿孔，細胞內大分子物質泄漏、代謝活力下降及菌體破裂等，從而達到抑菌殺菌功效[32]。

本研究獲得的產抗菌肽枯草芽孢桿菌B3菌株，經一系列試驗證明，其產生的抗菌肽對E.coli和S.entericasubsp.enterica具有高效的抑菌效果，而且部分理化性質穩定，具備開發為一種高效新型抑菌劑的潛質，可為新型抗菌肽的開發提供菌株來源。但如何保證抗菌肽在外源性蛋白酶中的穩定性，避免抗菌肽發生降解而降低活性等問題，將是今后進一步研究的重點。同時，由于目前對于抗菌肽的開發利用主要是基于其高效抑菌性和獨特抑菌機理而進行的。因此，探明枯草芽孢桿菌B3菌株來源抗菌肽的抑制作用機理也很必要，在開發相關產品之前亟待研究解決。

4 結論

綜合采用串聯柱層析法和反相色譜方法，從一株分離自甘肅河西鹽堿土壤中的枯草芽孢桿菌B3菌株(BacillussubtilisB3)發酵液中，分離純化出了一種對大腸桿菌(E.coli)和沙門氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)具有抑菌作用的抗菌肽，并以其菌株發酵產物為樣品，經串聯層析系統和反向色譜技術純化后的抗菌肽，通過MALDI-TOF-MS質譜對其進行了結構信息分析，結果表明該抗菌肽是一種小分子的富脯氨酸抗菌肽，其氨基酸序列Pro-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu，分子質量為1 567.86 Da，等電點為10.84。經NCBI數據庫比對，發現其為一種未報道的多肽。該抗菌肽對大腸桿菌(E. coli)和沙門氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)的最小抑菌質量濃度均為0.020 312μg/mL。同時，該抗菌肽表現出較強的耐熱性、耐酸堿性和光照穩定性。