產γ-氨基丁酸乳酸菌CICC 6238的誘變選育及益生特性分析

史曉萌，陳建國*，李生有，程池

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(承德先農科生物科技有限公司，河北 承德，068250)

乳酸菌是當今國際公認的食品安全級(Generally Recognized as Safe, GRAS)微生物，能夠代謝合成維生素、有機酸、細菌素和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)等物質。GABA是一種非蛋白質氨基酸，是中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，具有調節血壓、保護肝臟、改善腦機能、抗焦慮、預防和治療癲癇等多種生理功能[1-2]。與化學法合成GABA相比，乳酸菌生產的GABA具有副產物少、安全性高等優點。2009年我國衛生部批準希氏乳桿菌發酵生產的GABA為新資源食品，可用于普通食品及保健食品的生產。

乳酸菌不僅可以改善食品的營養和風味，提高食品的保藏性，還能調節腸道微生態平衡、提高免疫力以及輔助治療各類疾病等。目前國際上已經開發出多款具有自主知識產權的乳酸菌及其產品，如嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusNCFM、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusLGG和干酪乳桿菌LactobacilluscaseiLcS等。大量的研究表明，這些乳酸菌具有良好的耐受膽鹽、胃腸液能力，不僅被用于各種食品，還作為參照菌株用于乳酸菌益生功能研究[3-4]。與國外相比，國內在益生菌及其產品技術開發方面與歐美等國家尚存在差距。研發具有自主知識產權的益生菌種并進行工業化應用，正逐漸受到研究者和企業的重視。

目前含GABA功能因子益生菌產品研發過程中，在益生菌發酵的同時，一部分產品需要外源性添加GABA，但添加成本過高；另一部分添加具有產GABA功能的乳酸菌，但將產GABA乳酸菌與益生菌聯用開發產品的工藝較為復雜。因此篩選既產GABA又具有益生特性的乳酸菌，既能簡化生產工藝，又可降低生產成本，對相關產品研發具有重要意義。

本文從中國工業微生物菌種資源庫篩選得到產GABA植物乳桿菌LactobacillusplantarumCICC 6238，以商業益生菌嗜酸乳桿菌NCFM和鼠李糖乳桿菌HN001為參照菌株，研究CICC 6238對膽鹽、人工胃腸液的耐受性及其對常見腸道致病菌的抑制活性，旨在為CICC 6238用于功能性發酵食品及保健食品的開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

供試菌株：LactobacillusplantarumCICC 6238由中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)保藏；LactobacillusacidophilusNCFM和LactobacillusrhamnosusHN001從怡能80益生菌粉固體飲料中分離得到。

指示菌株：SalmonellaenteritidisCICC 21513、EscherichiacoliEHEC O157:H7 CICC 21530、ShigellaflexneriCICC 21534、StaphylococcusaureusCICC 21600，由CICC保藏。

1.2 培養基

MRS培養基、細菌瓊脂粉、營養瓊脂(NA)購自北京陸橋技術有限公司。發酵培養基：葡萄糖16 g，酵母浸粉15 g，蛋白胨5 g，乙酸鈉3 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.02 g，NaCl 0.001 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，L-谷氨酸鈉(MSG)10 g，pH 6.8[5]。

1.3 實驗試劑及儀器

胃蛋白酶(pepsin)(1∶3 000)、胰蛋白酶(Trypsin)(1∶250)購自Biotopped公司；牛膽鹽購自OXOID公司。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

Thermo Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀(DAD-3000 二極管陣列檢測器，Chromeleon 7色譜工作站)，Thermo Fisher公司；恒溫培養箱BHG-8082型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.4 產GABA乳酸菌的篩選

1.4.1 菌株活化及發酵培養

乳酸菌活化：用MRS固體斜面培養基進行菌株活化傳代，從活化的固體斜面培養基上挑取適量菌體接入5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養20 h。

發酵液培養：以2%的接種量將乳酸菌接種至10 mL含1%谷氨酸鈉的發酵培養基中，37 ℃靜置培養96 h。

1.4.2 發酵液中GABA的測定

1.4.2.1 薄層層析法定性測定GABA

取出發酵液，振蕩均勻，8 000 r/min離心10min，棄沉淀，取上清。以1 mg/mL的GABA標準液、1 mg/mL的L-Glu標準液為對照，每組點樣量為0.5 μL，點樣間距為1 cm，點樣的同時迅速用吹風機將點樣處吹干，以防樣品溶液擴散，影響層析效果。以V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶3∶1作展層劑，以0.4%茚三酮水飽和正丁醇試劑作顯色劑，置于80 ℃烘箱內，顯色10 min。

1.4.2.2 高效液相法定量測定GABA

取200 μL發酵液上清，加入800 μL OPA衍生液，振蕩5 s，過0.45 μm濾膜。

色譜分析條件色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：流動相A為純乙腈；流動相B為25 mmol/L乙酸鈉，用5%乙酸調pH至5.90。設置液相色譜流動相流速為1 mL/min，保持柱溫40 ℃，進樣量5 μL，檢測波長334 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.5 菌株CICC 6238的紫外誘變選育

1.5.1 最佳誘變條件的確定

將出發菌株CICC 6238接種到MRS液體培養基中37 ℃活化16 h，制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，吸取0.1 mL均勻涂布在平板上，在30 W紫外燈下距25 cm分別照射5、6、7、8、9和10 s。在黑暗條件下置于37 ℃培養48 h，待培養結束后計算菌落[6-7]。

1.5.2 突變菌株的篩選

培養好后，從平板上挑取長勢良好的菌株，使用薄層層析法對誘變后的菌株進行初篩，并使用高效液相法對突變株進行復篩，選出產量較高菌株進行下一輪誘變。將菌株CICC 6238在最佳紫外誘變條件下進行多次誘變篩選。

1.5.3 突變菌株的遺傳穩定性

將篩選到的突變菌株經過連續傳代培養，檢測2、4、6、8和10代菌株發酵液中GABA產量，以確定突變菌株的遺傳穩定性。

1.6 菌株生長及產GABA特性

1.6.1 菌株生長特性及產酸特性的測定

將菌株CICC 6238以2%的接種量接入MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養96 h，分別在0、4、8、12、16、20和24 h取樣，利用分光光度計測定其OD600nm值，以時間為橫坐標，OD600nm值和pH值為縱坐標，測定其生長特性和產酸特性。

1.6.2 菌株產GABA特性的測定

將菌株CICC 6238以2%的接種量接入發酵培養基中，37 ℃靜置培養96 h，分別在0、4、8、12、16、20、24、36、48、72、96和120 h取樣，用高效液相法測定其GABA和MSG含量，以時間為橫坐標，GABA和MSG含量為縱坐標，測定其產GABA特性。

1.7 菌株CICC 6238在模擬人體消化環境中的耐受力

1.7.1 供試菌株對膽鹽耐受能力的測定

以1%接種量將各供試菌液接種至含膽鹽(3.0 g/L)和不含膽鹽的MRS溶液中，37 ℃培養24 h，測定各菌株在含膽鹽和不含膽鹽的MRS培養基中生長時的OD600nm值，并計算存活率。

1.7.2 供試菌株對人工胃液和人工腸液耐受能力的測定

在pH值為3.0的滅菌生理鹽水中，加入10 g/L胃蛋白酶，充分溶解后過濾除菌，制成人工胃液。在pH值為8.0的滅菌生理鹽水中，加入10 g/L胰蛋白酶，充分溶解后過濾除菌，制成人工腸液。

將各菌株活化培養至24 h，取1 mL菌液離心收集菌體，取1.0 mL人工胃液懸浮后，加入到9.0 mL人工胃液中，37 ℃消化3 h，取樣，用平板計數法測定活菌數，以消化0 h的活菌數為對照，計算存活率。

吸取上述1.0 mL消化3 h、pH 3.0的人工含菌胃液，加入到9.0 mL人工腸液中，繼續于37 ℃消化6 h，取樣，用平板計數法測定活菌數，以人工胃液消化3 h后的活菌數為對照，計算存活率。

1.8 菌株CICC 6238的抑菌能力

1.8.1 指示菌平板的制備

指示菌平板分上下2層。首先加入8 mL瓊脂培養基作為下層培養基，完全凝固后輕輕放置4只牛津杯，然后加入20 mL NA培養基作為上層培養基。待上層培養基完全凝固后，取出牛津杯。

挑取新鮮培養的指示菌株，將菌懸液濃度調至0.5 McFarland并均勻涂布在平板上，放置20～30 min至平板表面無明顯菌液，備用。

1.8.2 乳酸菌抑菌實驗

將供試菌株活化后，按1%接種量接種于5 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，離心，取100 μL上清液加入指示菌平板的孔內，作為抑菌實驗孔；向孔中加入100 μL新鮮MRS培養液(pH 6.5)作為陰性對照孔。放入4 ℃冰箱擴散3 h后，置于37 ℃培養48 h，觀測有無抑菌圈，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，用抑菌圈外徑d(mm)表示抑菌作用的強弱。

1.9 數據分析

采用Origin 8.5軟件進行統計分析，數據結果以“平均值±標準差”(n=3)表示，各組數據之間進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析，p<0.05表示數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 產GABA乳酸菌的篩選

對產GABA乳酸菌相關文獻進行檢索[8-12]，報道最多的是植物乳桿菌，且多分離自發酵食品。本文從中國工業微生物菌種資源庫選出38株乳酸菌，包括15株植物乳桿菌和其他23株分離自發酵食品的乳酸菌，通過薄層層析法初篩和高效液相法復篩，從中篩選到1株GABA產量相對較高的乳酸菌，植物乳桿菌CICC 6238。圖1和圖2分別是GABA和MSG標準品及CICC 6238發酵液的液相色譜圖。經高效液相法定量測定，其產量為(0.513±0.024) g/L，下一步通過紫外誘變法提高其產量。

圖1 GABA和MSG標準品的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard GABA sample and MSG sample

圖2 菌株CICC 6238發酵液的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of fermentation broth of strain CICC 6238

2.2 菌株CICC 6238的紫外誘變

2.2.1 最佳誘變條件的確定

在紫外誘變選育中，大多傾向于選擇較低的誘變劑量，一般控制致死率為70%～90%。在實際工作中，突變率往往隨誘變劑量的增高而提高，如裴疆森[6]選育曲酸生產菌，及陳輝[7]等選育彩色納豆生產用菌時將存活率控制為約0.1%，有效地篩選出了正突變株。因此選擇存活率為0.1%的誘變劑量作為最佳誘變條件。

以CICC 6238為出發菌株，將經過紫外線處理的平板在黑暗條件下培養48 h后，5、6、7和8 s的平板不可計數，9 s平板上長有80～100個單菌落；10 s平板上的菌落數在10個以內。9 s的存活率約為0.1%，因此選擇9 s作為最佳誘變條件。

2.2.2 誘變結果

將CICC 6238在最佳誘變條件下進行4輪紫外誘變，通過薄層層析和高效液相法進行篩選后，最終得到1株高產突變株CICC 6238-445，GABA產量由原來的(0.513±0.024) g/L 提高到(1.196±0.033) g/L，是紫外誘變前的2.33倍，較出發菌株提高了133%。

2.2.3 突變菌株的遺傳穩定性

為驗證突變菌株的穩定性，將篩選到的突變菌株經過連續傳代培養，其2、4、6、8和10代菌株發酵液中GABA產量如圖3所示。由圖3可知，菌株CICC 6238-445平均產量為1.196 g/L，產量變化幅度很小，有較好的遺傳穩定性。后續試驗中將菌株CICC 6238-445作為CICC 6238的高產突變菌株進行產GABA特性、胃腸道耐受力及抑菌性能的研究。

圖3 菌株CICC 6238-445產GABA穩定性測定結果Fig.3 Genetic stability of GABA-production of stain CICC 6238-445

2.3 菌株CICC6238生長及產GABA特性

2.3.1 生長特性及產酸特性

由圖4可知，CICC 6238在0～4 h處于延滯期，生長和產酸較為緩慢；在4 h后進入對數生長期，生長迅速，產酸較快；16 h以后達到穩定期，生長及產酸趨于平衡，OD600nm值可達6.57±0.26，pH值達3.70±0.04。

圖4 菌株CICC 6238的生長及產酸曲線Fig.4 Growing curve and lactic acid production curve of strain CICC 6238

2.3.2 產GABA特性

圖5顯示了發酵液中GABA含量及MSG含量隨時間的變化情況。在36 h后，GABA的產量隨時間的延長而逐步增加；在60～84 h間，GABA產量迅速增加；96 h時GABA產量趨于平穩，達到(1.196±0.018) g/L。GABA在菌株CICC 6238達到穩定期之后才開始形成，屬于次生代謝產物。從MSG含量變化曲線可以看到，0～24 h內，MSG含量無明顯變化，24 h后逐漸下降，說明MSG開始作為前體物質用于合成GABA，96 h后MSG含量穩定至(7.550±0.079) g/L，GABA含量也隨之穩定。

圖5 菌株CICC 6238產GABA特性曲線Fig.5 GABA production curve of strain CICC 6238

2.4 菌株在模擬人體消化環境中的耐受性

乳酸菌發揮改善腸道菌群結構、抑制腸道致病菌等功能，首要條件是能以一定量的活菌狀態到達胃腸道。這要求乳酸菌能夠克服胃腸道中的物理及化學因素的影響[13]。對膽鹽、人工胃液和人工腸液的存活率這3項指標，被用來確定乳酸菌在胃腸道轉運中的耐受性[14]。本文以2株商業益生菌嗜酸乳桿菌NCFM和鼠李糖乳桿菌HN001為參照菌株，測定CICC6238在耐膽鹽、人工胃液、人工腸液中的耐受性。

2.4.1 耐膽鹽實驗

膽鹽是肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y合形成的鈉鹽或鉀鹽，它是膽汁參與消化和吸收的主要成分。人體小腸中膽鹽的質量濃度范圍約0.3～3 g/L，在體外研究對膽鹽的耐受性時，多采用3 g/L的膽鹽環境[15]，因此本實驗中牛膽鹽添加量為3.0 g/L。

各菌株在含3.0 g/L牛膽鹽的培養基中存活率如表2所示。結果顯示CICC 6238耐膽鹽存活率為(36.90±1.63)%，顯著高于商業益生菌嗜酸乳桿菌NCFM[(15.16±1.73)%]，但低于商業益生菌鼠李糖乳桿菌HN001[(46.81±0.26)%]。

表2 各株乳酸菌對牛膽鹽的耐受力Table 2 Tolerance of the each probiotics to bile salt

注：表中標注不同小寫字母表示數據間差異顯著(p<0.05)。

2.4.2 人工胃液、人工腸液耐受性實驗

食物在胃內的停留時間通常為3～4 h，流體一般為1～3 h。根據飲食結構的不同，人體胃液的pH值波動很大，通常在pH 3.0左右，胃液的這種酸性環境可以將胃蛋白酶原激活變成胃蛋白酶，從而殺死隨食物進入胃內的細菌。益生菌如果要在人體內發揮益生作用，就必須具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶能力。食物經過胃液消化后，進入腸道，小腸的pH值大約為7.6，食物在小腸中的停留時間一般為2～6 h[16]。因此，本文選擇人工胃液的pH為3.0，培養時間為3 h；人工腸液的pH為8.0，培養時間為6 h。

各菌株在人工胃液消化3 h后的存活率和在人工腸液消化6 h后的存活率如圖6所示。在人工胃液消化3 h后，CICC 6238的存活率為(84.05±1.87)%，顯著高于HN001[(61.97±2.45)%](p<0.05)，與NCFM[(87.55±3.68)%]無顯著差異(p>0.05)。在人工腸液消化6 h后，CICC 6238的存活率為(61.50±1.94)%，低于HN001[(77.44±3.08)%]和NCFM[(79.42±2.08)%]。

2.5 抑菌性能試驗

以HN001和NCFM為參照菌株，測定植物乳桿菌CICC6238對4種常見腸道致病菌的抑制能力。3株乳酸菌CICC 6238、HN001和NCFM對4種腸道致病菌的抑菌圈如圖7所示。由圖7可知，加入新鮮MRS培養液(pH 6.5)(陰性對照)，沒有出現抑菌圈，而加入乳酸菌上清液則出現不同大小的抑菌圈。

圖6 各株乳酸菌在pH 3的人工胃液中37 ℃培養3 h及在人工腸液中37 ℃培養6 h耐受能力比較Fig. 6 Comparison of tolerance capacity of the each probiotics in simulated gastric juice with pH 3 incubated at 37 ℃ for 3 hours and in simulated intestinal fluid incubated at 37 ℃ for 6 hours注：同一組柱狀圖上標注不同小寫字母表示數據間差異顯著(p<0.05)。

a-金黃色葡萄球菌；b-出血性大腸埃希氏菌；c-腸炎沙門氏菌；d-福氏志賀氏菌圖7 乳酸菌抑菌實驗結果Fig.7 Antibacterial activity test of 3 probiotics

各菌株對4種腸道致病菌的抑菌圈大小如圖8所示。由圖8可知，CICC 6238均可顯著抑制金黃色葡萄球菌、出血性大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌和福氏志賀氏菌的生長；其中，CICC 6238對福氏志賀氏菌的抑菌圈達到(28.31±0.27) mm，與HN001[(27.03±1.03)mm]和NCFM[(28.16±0.08)mm]無顯著差異(p>0.05)；對金黃色葡萄球菌、出血性大腸埃希氏菌和腸炎沙門氏菌的抑菌圈分別為(19.59±0.16)、(19.75±0.27)和(22.25±0.64) mm，顯著優于HN001和NCFM(p<0.05)。

圖8 各株乳酸菌抑菌性能Fig.8 Antibacterial activity of the each probiotics注：同一組柱狀圖上標注不同小寫字母表示數據間差異顯著(p<0.05)。

3 討論

近年來隨著益生菌市場的不斷壯大，篩選具有自主知識產權的益生菌株并進行工業化應用研究，正在逐漸受到國內科技界和企業界的重視。內蒙古農業大學的張和平課題組經過多年的研究，選育出多株優良益生菌株，如乳酸雙歧桿菌BifidobacteriumlactisV9[17-18]、瑞士乳桿菌LactobacillushelveticusH9[19]和干酪乳桿菌LactobacilluscaseiZhang[20-21]等，并應用于多種活性乳酸菌飲料的生產。南昌大學謝明勇課題組選育出植物乳桿菌LactobacillusplantarumNCU116等多株具有優良果蔬發酵特性的乳酸菌，對其益生特性進行評價后，將其用于泡菜和胡蘿卜漿的發酵[22-24]。

本文從中國工業微生物菌種資源庫優選的38株乳酸菌中篩選到的1株產GABA的植物乳桿菌LactobacillusplantarumCICC 6238，經高效液相法定量測定，其產量為0.513 g/L，略高于張竺英[25]等報道的戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus0.161 g/L和PARK[26]等報道的Lactobacillusplantarum0.155 g/L，但與曾小群[27]等報道的戊糖乳桿菌1.6 g/L和CHO[28]等報道的短乳桿菌Lactobacillusbrevis1.11 g/L還有一些差距。對其進行紫外誘變后，菌株CICC 6238的GABA產量由0.513±0.024 g/L提高到1.196±0.033 g/L，是紫外誘變前的2.33倍。與商業益生菌HN001和NCFM相比，菌株CICC 6238對膽鹽、人工胃液、人工腸液有很好的耐受性，并且對4種腸道致病菌尤其是福氏志賀氏菌具有明顯的抑制作用，這表明CICC 6238具有潛在的益生特性。本文篩選到的CICC 6238既有較好的GABA生產能力，又具有在模擬人體消化環境中的耐受力和對腸道致病菌的抑制作用，可作為功能性乳酸菌資源，用于發酵食品的研制，下一步將重點研究其發酵關鍵技術及其產業化應用。