一例Crouzon綜合征合并黑棘皮病患兒FGFR3基因突變分析

計(jì)雄飛 紀(jì)超 唐珊 郭春燕 程波

350000福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院福建省皮膚病分院（計(jì)雄飛、紀(jì)超、唐珊、程波）；福建省龍巖市第一醫(yī)院皮膚科（郭春燕）

Crouzon綜合征是顱縫早閉引起的顱腔狹小、眶淺和眼球突出、鷹鉤鼻等顱面畸形。黑棘皮病是以皮膚色素沉著、角化過(guò)度、天鵝絨樣增生為特征的皮膚角化性疾病。Crouzon綜合征合并黑棘皮病（CAN）少見(jiàn)，由特定的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3（FGFR3）基因突變引起，是一種獨(dú)立的疾病，有學(xué)者稱(chēng)之為Crouzon樣皮膚骨骼綜合征（Crouzono?dermo?skeletal syndrome）［1］。我們通過(guò)PCR 及 DNA 測(cè)序檢測(cè) 1例CAN患兒FGFR3基因突變情況。

一、資料和方法

1.病歷資料：患兒女，7歲，前額突出、突眼伴全身皮膚色素沉著7年。生后1周即發(fā)現(xiàn)雙肘內(nèi)側(cè)色素沉著，1年后全身皮膚漸出現(xiàn)多處色素沉著。自幼淚管堵塞，多次疏通效果不明顯?；純焊改刚＃墙H婚配，無(wú)相同疾病家族史。體檢：身高135 cm，全身淺表淋巴結(jié)無(wú)腫大，心肺無(wú)異常。頭顱呈方形，前額突出，上頜發(fā)育不全，下頜前凸；眼球突出，雙眼間距較寬；鼻梁塌陷，上下牙咬合不良，牙列不整，參差不齊（圖1A）。皮膚科檢查：全身皮膚黑褐色，頸部及腋下、腹股溝等部位皮膚粗糙，皮棘稍隆起，呈天鵝絨樣外觀（1B）。腹部皮損組織病理（圖2）：表皮角化過(guò)度，棘層肥厚，基底層可見(jiàn)色素沉著，真皮淺層擴(kuò)張毛細(xì)血管周?chē)倭柯匝装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。頭顱MRI（圖3）：橫斷面T2WI示雙側(cè)腦室擴(kuò)大，雙側(cè)額部蛛網(wǎng)膜下腔略增寬；矢狀面T2WI示小腦扁桃體上下徑增寬，下緣尖銳，超過(guò)枕骨大孔0.3 cm。符合Chiari畸形伴梗阻性腦積水。診斷：CAN。本研究通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人及正常人均簽署知情同意書(shū)。

2.提取基因組DNA：分別抽取患兒及患兒父母、100例無(wú)親緣關(guān)系的健康人靜脈血各3Ml，放置于5Ml乙二胺四乙酸抗凝管中，-80℃儲(chǔ)存，并用DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA濃度及純度。

3.引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：從數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得FGFR3基因組序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)FGFR3基因的引物，正向引物：5′?TGGCGTTACTGAC TGCGAGA?3′，反向引物：5′?GTTTCGTGCCCCAAAGTACC?3′；片段長(zhǎng)度521 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以患兒及其父母基因組DNA為模板，用Ex Taq聚合酶等PCR試劑（大連Takara公司）擴(kuò)增FGFR3基因的外顯子及其側(cè)翼序列。PCR體系總體積20μl，含模板DNA 50 ng、正反向引物（20μmol/L）各0.5μl、Ex Taq Mix 10μl，加ddH2O補(bǔ)至20μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。

4.DNA測(cè)序：PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后用美國(guó)Applied Biosystems公司ABI3730XL型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，Chromas V2.23軟件比對(duì)分析測(cè)序數(shù)據(jù)。用Chromas軟件（版本2.0）分析基因序列，確定突變位點(diǎn)。

二、結(jié)果

患兒FGFR3基因第10外顯子有1個(gè)雜合錯(cuò)義點(diǎn)突變（C.1172 C＞A），導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)楣劝彼幔≒.Ala391Glu）；患兒父母及100例無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)該突變。見(jiàn)圖4。

三、討論

CAN由FGFR3基因突變引起［2］，F(xiàn)GFR3的不同致病性突變可引起不同臨床表現(xiàn)。有報(bào)道FGFR3 p.Lys650Thr突變可導(dǎo)致黑棘皮病改變，而無(wú)明顯顏面和骨骼異常；p.Lys650Gln突變可導(dǎo)致季肋發(fā)育不全伴黑棘皮??；p.Ser348Cys突變導(dǎo)致中等程度軟骨發(fā)育不全和黑棘皮?。?］。我們檢測(cè)到該例患兒存在FGFR3基因1172位核苷酸C＞A替換突變，使該位點(diǎn)所編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)楣劝彼幔ˋla391Glu），該突變可能是導(dǎo)致CAN的原因。FGFR3基因編碼的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3是一種跨膜受體酪氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化、增殖、遷移和血管再生以及傷口愈合過(guò)程。FGFR3可能通過(guò)參與良性表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖導(dǎo)致黑棘皮?。?］。有研究顯示，F(xiàn)GFR3的A391E基因突變導(dǎo)致細(xì)胞表面活性突變受體表達(dá)減少，弱化信號(hào)傳遞，從而引起臨床表型的發(fā)生［4］。

臨床上CAN除具有Crouzon綜合征的一般癥狀外，還可有一些特征性的變化，如后鼻孔閉鎖、腦積水、胼胝體和小腦蚓體發(fā)育不全［5］等。骨骼表現(xiàn)包括牙骨質(zhì)瘤和牙骨質(zhì)發(fā)育不良。此外，還可能有軟骨發(fā)育不全的特征，如小的坐骨切口、短指等［6］。CAN患者表現(xiàn)為泛發(fā)的棕褐色，天鵝絨樣色素過(guò)度沉著，在身體皺褶部位表現(xiàn)更為明顯，如口周、眼周、腋下、頸部。黑棘皮病的癥狀往往表現(xiàn)較早，通常在青春期前就表現(xiàn)出來(lái)，其嚴(yán)重程度有一定的差異［1］。有報(bào)道出生后即有黑棘皮病表現(xiàn)［7］。本文患兒出生時(shí)伴有顱面畸形，漸出現(xiàn)腦積水癥狀，影像學(xué)檢查符合Chiari畸形伴梗阻性腦積水。患兒未做腦脊液引流，隨訪至今，智力發(fā)育正常，可能和顱內(nèi)壓升高不明顯、未對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成明顯損害有關(guān)?；純哼€出現(xiàn)牙列不整、參差不齊、牙骨質(zhì)發(fā)育不良和淚管堵塞，國(guó)外未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道?；純撼霈F(xiàn)黑棘皮病的表現(xiàn)早，漸蔓延擴(kuò)散，以皺褶及眶周明顯，較普通的黑棘皮病受累廣泛。

圖1 患兒臨床表現(xiàn) 頭顱呈方形，前額突出，上頜發(fā)育不全，下頜前凸；眼球突出，雙眼間距較寬；鼻梁塌陷，上下牙咬合不良（1A）。全身皮膚黑褐色，以頸部及腋下、腹股溝等部位明顯，皮膚粗糙，皮棘稍隆起，呈天鵝絨樣外觀（1B）

圖2 腹部皮損組織病理 表皮角化過(guò)度，棘層肥厚，基底層可見(jiàn)色素沉著，真皮淺層擴(kuò)張毛細(xì)血管周?chē)倭柯匝装Y細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×100）

圖3 頭顱MRI 矢狀面T2WI示小腦扁桃體上下徑增寬，下緣尖銳，超過(guò)枕骨大孔0.3 cm

圖4 患兒及其父母測(cè)序圖 患兒攜帶c．1172C＞A雜合突變位點(diǎn)（箭頭所示）；患兒父親、母親及健康人未顯示突變

臨床上，大多數(shù)CAN患者在出現(xiàn)黑棘皮病表現(xiàn)前未做基因檢測(cè)，僅能做出Crouzon綜合征的診斷，明確診斷需要結(jié)合FGFR3突變情況。CAN被認(rèn)為是常染色體顯性遺傳，本文家系中僅患兒出現(xiàn)FGFR3基因突變，其父母及健康對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)此突變，考慮為新發(fā)突變，與既往報(bào)道一致［8］。