薏苡仁提取物對BALB/c小鼠特應性皮炎模型的療效觀察及機制探討

王俊霞 楊子微 車雅敏 單士軍 陳洪鐸

300052天津醫科大學總醫院皮膚性病科（王俊霞、楊子微、車雅敏、單士軍）；中國醫科大學附屬第一醫院皮膚性病科（陳洪鐸）

特應性皮炎（AD）的發生與遺傳、環境、免疫等因素密切相關［1］。薏苡仁是禾本科植物薏苡的種子［2］，其活性成分主要為薏苡仁油、薏苡仁多糖、薏苡仁油多肽等，具有增強免疫力、抗炎、抗腫瘤等多種作用［3］。我們探討薏苡仁提取物（theextraction of Semen Coicis，ESC）對AD模型小鼠的治療效果，初步探討其作用機制。

一、材料

1.動物：SPF級純系健康BALB/c雌性小鼠40只，6～8周齡，體重20～ 22 g，動物合格證號SCXK（京）2014?0004，由天津醫科大學動物中心提供。

2.試劑與儀器：2，4-二硝基氯苯（DNCB）來自美國Sigma公司，ESC及其基質由鉑唯愛天津生物科技有限公司提供，ESC為10%（v/v）薏米油提取物，基質包括卵磷脂和一些賦形劑。白細胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）ELISA檢測試劑盒來自天津賽東南生物技術有限公司。

二、分組及處理

1.分組及處理：40只小鼠采用隨機數字表法隨機分為空白組8只、模型組32只。造模完成后，空白組8只、模型組8只立即處死，另24只小鼠隨機分為模型對照組、ESC組、基質組，每組8只。各組小鼠分籠飼養，保持自由飲水和標準飲食，定期清潔消毒。

2.造模：小鼠在室溫（25±1）℃和60%濕度條件下適應性喂養1周。實驗前1天用10%硫化鈉溶液背部脫毛（面積2 cm×2 cm）；實驗第1～3天每天將100μl 1%DNCB溶液（以丙酮和橄欖油1∶4作為基質配制而成）外涂于小鼠背部脫毛區及雙耳部；第4天開始改用0.1%DNCB 100μl，每2天外涂1次，直到第28天［4］。造模第28天，模型組小鼠背部出現紅斑、丘疹、滲出、結痂，耳部出現腫脹、紅斑，在該組8只小鼠背部取材行病理檢查，摘眼球取血，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心20min，分離上清液，-80℃冰箱保存備用。

3.治療方案：模型對照組不予任何處理，ESC組和基質組小鼠每天背部皮損分別涂抹ESC或基質，每次200μl，涂抹后按摩小鼠皮損處，使其充分吸收，連續4周。根據小鼠與人體的體表面積比例換算給藥劑量，即200μl/cm2，薏苡仁提取物的濃度為10%（參考既往研究薏苡仁提取物對細胞生長影響實驗所得出的最適濃度［5］）。末次給藥12 h后，3組小鼠均摘除眼球取血，靜置后離心，留取血清備用。在所有小鼠背部皮損處取5mm2組織標本，4%甲醛固定備用。

三、觀察指標及方法

1.小鼠皮損表現：造模完成及末次給藥12 h后觀察各組小鼠背部皮損大體表現，將紅斑、滲出、結痂、搔抓、干燥分別按正常（0分）、輕度（1分）、中度（2分）、重度（3分）評分。

2.小鼠耳部皮損厚度：用測厚儀于造模前、造模完成及末次給藥12 h后測量各組小鼠左耳厚度。

3.組織病理學觀察：對組織標本行石蠟包埋切片、HE染色，觀察每組小鼠表皮、真皮改變。甲苯胺藍染色，觀察肥大細胞浸潤情況，計算每組10個高倍（×400倍）視野下肥大細胞數，取平均值。

4.水通道蛋白3（AQP3）、Toll樣受體2（TLR2）和TLR4表達檢測：石蠟切片脫蠟水化，抗原修復，加兔抗鼠一抗（TLR2多克隆抗體，1∶100稀釋；AQP3多克隆抗體，1∶200稀釋；TLR4多克隆抗體，1∶400稀釋），加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（美國Sigma公司），雙花扁豆凝集素（DBA）顯色，封片觀察。

5.血清細胞因子檢測：按試劑盒說明書操作，ELISA法檢測血清IgE、IL?4和IFN?γ水平。

6.統計學分析：采用SPSS19.0統計軟件，實驗數據以x±s表示，方差齊性檢驗后，兩樣本均數間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析及SNK法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

四、結果

1.小鼠皮損表現：造模第28天，空白組小鼠皮膚沒有任何變化，模型組小鼠皮膚出現不同程度的紅斑、干燥、抓痕、結痂，煩躁。給藥第28天，ESC組小鼠皮損緩解，其臨床癥狀評分與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），基質組與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

2.小鼠耳部皮損厚度：治療28天后，基質組、模型對照組、ESC組左耳厚度兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.01）。見表1。

3.小鼠背部皮損組織病理表現：造模完成后，空白組小鼠表皮薄，真皮膠原規則，附屬器正常，無炎癥細胞浸潤；模型組表皮角化過度、角化不全、漿液滲出，表皮棘層增厚，細胞間水腫，真皮顯著炎癥細胞浸潤，見圖2A、2B。治療28 d時模型對照組和基質組表皮輕度增生，細胞間水腫，真皮中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；ESC組表皮稍增厚，伴真皮內稀疏炎癥細胞浸潤。見圖2。ESC組與模型對照組及基質組比較真皮浸潤的肥大細胞數差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

圖1 各組小鼠皮損表現 造模完成后空白組小鼠幾乎沒有變化，模型組小鼠背部出現不同程度的紅斑、抓痕、結痂。治療28 d后，薏苡仁提取物組小鼠皮損消退，表皮光滑；模型對照組和基質組仍可見脫屑、增厚

圖2 特應性皮炎造模完成后及治療28 d時各組小鼠皮損病理表現（2A、2B：HE×200；2C～2E：HE×100）

表1 特應性皮炎小鼠臨床癥狀評分、皮損厚度、真皮肥大細胞浸潤程度比較（±s）

表1 特應性皮炎小鼠臨床癥狀評分、皮損厚度、真皮肥大細胞浸潤程度比較（±s）

注：a與模型對照組比較，P＜0.05；b與基質組比較，P＜0.05

組別模型對照組薏苡仁提取物組基質組F值P值n值8 8 8臨床癥狀評分2.50±0.58 1.50±0.58a 2.25±0.50 7.20＜0.001鼠耳厚度（mm）0.33±0.01b 0.31±0.01ab 0.28±0.01 16.10＜0.001浸潤肥大細胞數（個/400倍視野）28.94±1.28 15.18±1.64a 28.08±2.15 8.40＜0.01

4.免疫組化檢測結果：見圖3。治療28 d時，模型對照組AQP3表達高于基質組但低于ESC組；模型對照組TLR2和TLR4表達高于基質組，ESC組TLR2和TLR4較模型對照組表達下降。基質組與模型對照組AQP3及TLR2和TLR4表達差異無統計學意義（均P＞0.05）。

5.血清IgE、IL?4和IFN?γ水平：見表2。造模完成后，模型組外周血IgE、IL?4水平顯著高于空白組（q值分別為-6.88、-5.07，均P ＜ 0.05），IFN?γ水平顯著低于空白組（q=8.50，P ＜ 0.05）。治療28 d時，ESC組外周血IgE、IL?4水平顯著低于模型對照組（q值分別為6.63、8.95，均P ＜ 0.05），IFN?γ水平高于模型對照組（q=-4.78，P＜0.05），基質組與模型對照組相比，上述指標差異無統計學意義（均P＞0.05）。

五、討論

半抗原法是目前比較常用的AD造模方法，此方法也在文獻［6］中提及，即采取小劑量DNCB多次刺激小鼠，產生的皮膚炎癥反應類似于人類的AD。這種方法已經大量應用于基礎實驗及臨床。本研究用DNCB作為致敏劑刺激小鼠進行造模，刺激完成后小鼠背部皮膚出現紅斑、滲出、結痂等典型皮損，說明成功建立AD小鼠模型。

Outside?inside是近年來比較認可的關于AD發病機制的一種假說，Outside指基因、環境等因素造成皮膚屏障功能的破壞；inside指皮膚屏障功能受損，引起Th2細胞活化、細胞因子分泌增多等一系列超敏反應［7］。各種因素導致皮膚屏障功能受損，致敏原通過受損皮膚屏障進入機體，Th2細胞活化導致IL?4生成增多，誘導IgE產生；IL?4還可以抑制IFN?γ誘導皮膚轉錄，使IFN?γ對IgE合成的抑制作用減弱［8?9］。因此IgE、IL?4、IFN?γ是AD治療的重要靶點。我們用DNCB致敏BALB/C小鼠，構建AD小鼠模型，并外用ESC治療，結果顯示，模型對照組小鼠血清IgE、IL?4水平升高，IFN?γ下降；模型小鼠經ESC治療后，血清IgE、IL?4水平下降，IFN?γ水平升高，說明ESC可降低AD模型組小鼠IgE、IL?4水平，升高IFN?γ水平。

AQP在維持皮膚的水合平衡中有重要意義［10］，AQP3表達異常是AD的病理機制［11］之一。健康小鼠皮膚AQP3主要定位于基底層及皮膚附屬器。AD患者AQP3棘層表達增加［12］。本研究中，AQP3在空白組小鼠僅表達在基底層；治療28 d后，模型對照組基底層及棘層AQP3表達增加，ESC組AQP3表達恢復到基底層，棘層極少，說明ESC可調控AQP3表達。

圖3 治療28 d時小鼠皮膚水通道蛋白3和Toll樣受體2、4表達變化（雙花扁豆凝集素×200）

表2 各組小鼠血清中白細胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）水平比較（± s，ng/L）

表2 各組小鼠血清中白細胞介素4（IL?4）、IgE、干擾素γ（IFN?γ）水平比較（± s，ng/L）

注：n=8。a與空白組比較，P＜0.05；b與模型對照組比較，P＜0.05

組別空白組模型組模型對照組薏苡仁提取物組基質組IgE 5.81±1.30 9.06±0.99a 11.30±0.51 6.800±1.25b 10.64±0.12 IL?4 62.12±13.02 96.86±1.82a 98.34±9.03 53.81±4.17b 91.95±5.68 IFN?γ 64.11±6.15 42.20±6.45a 43.65±1.87 70.18±10.94b 44.93±1.20

TLR是近年來發現的一類重要的模式識別受體［13］。TLR可識別微生物高度保守成分即病原體相關分子模式（pathogen?associated molecular pattern，PAMP），通過激活NF?kB信號通路介導天然免疫及炎癥反應［14］。TLR2和TLR4受體幾乎存在于所有的病原微生物中，兩者細胞定位不同，其中TLR2識別革蘭陽性細菌的肽聚糖及真菌的甘露聚糖，TLR4識別革蘭陰性細菌的脂多糖（LPS），刺激肥大細胞通過產生細胞因子參與炎癥反應，都與AD的發生密切相關。研究發現，角質形成細胞不但是構成皮膚屏障的結構細胞，還是參與皮膚天然免疫的重要細胞［4］，角質形成細胞誘導性過度表達TLR2和TLR4形成的天然免疫與AD的炎癥反應有關。本研究中治療28 d時，模型對照組小鼠TLR2和TLR4在表皮全層角質形成細胞膜及胞質過度表達，以細胞膜為主，而ESC組TLR2和TLR4表達下降，說明薏苡仁提取物可降低TLR2和TLR4表達，抑制AD的免疫反應。

綜上，本研究中ESC明顯減輕AD模型小鼠耳部腫脹、改善皮膚炎癥反應程度，同時降低血清IgE、IL?4水平，升高IFN?γ水平，調節皮膚AQP3、TLR2和TLR4的表達。提示ESC對AD模型小鼠有良好治療效果，可能是通過調節血清IgE、IL?4及IFN?γ等炎癥因子水平和影響AQP3、TLR2和TLR4的表達、抑制免疫反應來實現。本研究為AD治療提供了新策略。