白細胞介素22對人表皮角質形成細胞CC趨化因子配體27表達的影響

周文嬌 任杰 韓瓏 劉欣欣 湯坤龍 羅素菊

300052天津醫科大學總醫院皮膚科（周文嬌、任杰、韓瓏、羅素菊），泌尿外科（湯坤龍）；天津市兒童醫院皮膚科（劉欣欣）

CC趨化因子配體27（CCL27）是皮膚發育和角質形成細胞分化過程中發揮調節作用的重要因子之一［1］，研究表明，CCL27及其受體CCR10在銀屑病皮損的角質形成細胞及血清中異常表達［2?6］。我們的前期［7?8］研究表明，白細胞介素22（IL?22）作為Th22細胞的效應因子，可促進HaCaT細胞增殖，抑制HaCaT細胞凋亡和分化，并且可通過MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路誘導肝素結合表皮生長因子樣生長因子（heparin?bingding epidermal?growth?factor?like growth factor）表達和抑制他扎羅汀誘導基因3（tazarotene?induced gene 3）表達。推測IL?22也可以通過這兩條信號通路對在角質形成細胞分化過程中起重要作用的CCL27存在調控作用。本研究進一步探討銀屑病中IL?22對趨化因子CCL27表達的調控。

一、材料與方法

1.細胞株及主要材料：HaCaT細胞系由德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫學中心惠贈，在實驗室長期保存。重組人IL?22（美國 Protein Specialists公司），抗人 CCL27/CTACK抗體（美國RD公司），抗β肌動蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），PD98059（MAPK?ERK1/2通路抑制劑）、AG490（JAK2/STAT3通路抑制劑）（美國Millipore公司），DMEM培養基（美國Gibico公司），人CCL27酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（美國RD公司），超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

2.免疫組化檢測銀屑病患者皮損中CCL27的表達：10例銀屑病組織標本來自天津醫科大學總醫院皮膚科病理組織蠟塊，男5例，女5例，年齡18～50歲（平均22.3歲），其中2例來自頸后部，8例來自軀干；5例健康人皮膚標本來自天津醫科大學總醫院整形美容科，男3例，女2例，年齡20～36歲（平均23.5歲），其中1例來自面部，1例來自頸部，3例來自軀干。本研究獲得天津醫科大學總醫院醫學倫理委員會批準，受檢者均簽署知情同意書。采用超敏二步法免疫組化檢測，按產品說明書操作，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，脫水、封片，顯微鏡下觀察。

3.細胞培養及分組：HaCaT細胞復蘇后，置于37℃、5%CO2孵箱中用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液培養。取對數生長期細胞進行消化，按1×105/Ml接種于6孔板中，待細胞70%～80%融合時，更換成含有0.5%胎牛血清的DMEM培養液饑餓處理2 h，之后更換新的培養液，分為8組，對照組用PBS處理；干預組分別用12.5、25、50、100、200μg/L重組人IL?22干預；通路阻斷組先分別加入50μmol/L AG490或50μmol/LPD98059阻斷干預，2 h后各加入50μg/L（依據課題組前期研究［7?8］確定）IL?22。上述處理完成后，繼續于37℃、5%CO2孵箱中培養24 h。

4.Western印跡檢測CCL27蛋白表達：將上述各組HaCaT細胞用冷PBS洗3遍，每孔加100μl細胞裂解液和1μl蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF），于冰上裂解30min，收集細胞裂解液，4℃下離心（13 200×g）10min，取上清液。BCA法測蛋白濃度后進行Western印跡。用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為30μg，電泳90min，穩流300mA，轉膜40min，加入抗人CCL27/CTACK抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育2 h，ECL顯色。蛋白條帶灰度值采用Image?pro plus3.0軟件分析，以CCL27與內參β肌動蛋白的灰度值比值表示CCL27相對表達水平。實驗重復3次。

5.ELISA法檢測細胞培養上清液中CCL27含量：取上述各組HaCaT細胞上清液，按試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm和570 nm處讀取吸光度A值，建立標準曲線，獲得樣品中趨化因子CCL27的含量。實驗重復3次。

6.統計學分析：計量資料用x±s表示。采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和Dunnett?t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

二、結果

1.CCL27表達：銀屑病患者皮損中，CCL27在表皮全層角質形成細胞胞質中均有表達。而對照組中，CCL27主要表達于表皮基底層角質形成細胞胞質中，基底層以上表達較弱。見圖1。

圖1 CC趨化因子配體27（CCL27）在健康人皮膚及銀屑病皮損中的表達（DAB染色）

2.IL?22干預及阻斷MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3信號通路后HaCaT細胞中CCL27蛋白表達：Western印跡檢測顯示，12.5～200μg/L IL?22干預組和對照組HaCaT細胞CCL27表達量差異有統計學意義（F=314.722，P＜0.01），且IL?22干預組均顯著高于對照組（P＜0.01）。IL?22+AG490組、IL?22+PD98059組與50 μg/L IL?22組間CCL27表達量差異有統計學意義（F=358.706，P＜0.01），且前兩組均顯著低于50μg/L IL?22組（均P＜0.01）。見圖2、表1。

圖2 白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27（CCL27）表達的影響 1：對照組；2 ～ 6：分別為12.5、25、50、100、200 μg/L IL?22組；7：50 μg/L IL?22+AG490組；8：50 μg/L IL?22+PD98059組

表1 Western印跡法與ELISA法檢測不同濃度白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27表達的影響（±s）

表1 Western印跡法與ELISA法檢測不同濃度白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27表達的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較，P＜0.01；b與50 μg/L IL?22組比較，P＜0.01

組別對照組12.5 μg/L IL?22 25 μg/L IL?22 50 μg/L IL?22 100 μg/L IL?22 200 μg/L IL?22 50 μg/L IL?22+AG490 50 μg/L IL?22+PD98059 Western印跡法0.413±0.013 0.491±0.013a 0.620±0.019a 0.623±0.014a 0.802±0.052a 1.138±0.013a 0.411±0.019b 0.280±0.012b ELISA法（ng/L）26.370±0.490 33.403±0.748a 34.710±0.980a 37.486±0.748a 38.473±0.753a 39.783±1.020a 27.586±0.288b 35.846±0.757b

ELISA檢測顯示，12.5～200μg/L IL?22干預組與對照組CCL27分泌量差異有統計學意義（F=108.307，P＜0.01），且IL?22干預組均顯著高于對照組（P＜0.01）。IL?22+AG490組和IL?22+PD98059組與50μg/L IL?22組間差異亦有統計學意義（F=208.192，P＜0.01），且前兩組均顯著低于50μg/L IL?22組（P＜0.01）。見表1。

三、討論

本研究結果示，12.5～200μg/L IL?22干預處理后HaCaT細胞中CCL27表達水平升高，同時IL?22也可以促進HaCaT細胞分泌CCL27；加入信號通路阻斷劑后CCL27表達均較未加抑制劑組減少。表明IL?22對CCL27的合成與分泌有促進作用；MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3信號通路在其中發揮了重要作用。

目前研究認為，CCL27是皮膚發育和角質形成細胞分化調節的重要因子之一［1］，主要由皮膚表皮角質形成細胞產生，大部分表達于胞質中，在銀屑病患者皮損中CCL27mRNA和蛋白含量比銀屑病非皮損區顯著升高，并且在銀屑病患者血清中CCL27水平升高［5?6］，CCL27與CCR10結合，趨化淋巴細胞進入皮膚，在T細胞介導的免疫反應中發揮重要作用。

對皮膚T細胞淋巴瘤的研究表明，血清IL?22水平與血清乳酸脫氫酶、可溶性IL?2受體及CCL27有關［9］。有研究表明，T細胞來源的TNF?α以及IL?1β可誘導CCL27表達，而IL?17可抑制人正常皮膚角質形成細胞中CCL27表達［10］。這些炎癥因子都是銀屑病發病的重要因子，IL?22是銀屑病發病的另一重要炎癥因子，因此我們推測，IL?22在銀屑病患者體內可以干擾表皮CCL27的表達，進而影響角質形成細胞增殖和分化及表皮炎癥浸潤。結合前期研究［7?8］和本研究結果，我們推測IL?22可能通過MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路影響CCL27表達。在銀屑病患者皮損中，CCL27與其受體CCR10結合，在銀屑病的角質形成細胞和淋巴細胞的相互作用中繼續發揮作用，從而刺激表皮角質形成細胞的異常增殖、分化及炎癥浸潤［11］，其具體機制有待進一步研究。