n?3多不飽和脂肪酸對SKH?1小鼠皮膚急性光損傷模型的保護作用研究

徐雨婷 王佩茹 韓佳彤 王秀麗

200443上海，安徽醫科大學上海皮膚病臨床學院（徐雨婷）；上海市皮膚病醫院同濟大學醫學院光醫學研究所（王佩茹、韓佳彤、王秀麗）

紫外線照射可引起急性光損傷、光敏性皮膚病、免疫抑制、慢性光老化等［1?2］。膳食中n?3、n?6多不飽和脂肪酸（PUFA）是人體必需脂肪酸，其中n?3 PUFA在心血管系統、結腸腫瘤防治方面發揮保護作用［3］。白種人n?3 PUFA攝入和皮膚光老化呈負相關［4］。既往研究表明，膳食補充n?3 PUFA可減少炎癥介質白細胞介素1β（IL?1β）、IL?6、腫瘤壞死因子α（TNF?α）等的產生，從而減輕炎癥反應，調節免疫功能［5］。但是，膳食補充n?3 PUFA是否可以減輕紫外線引起的光損傷以及具體劑量尚不清楚。我們在紫外線誘導的SKH?1無毛小鼠急性光損傷模型上，評估n?3 PUFA攝入對皮膚光損傷的防護作用，確定有效劑量，初步探索作用機制。

材料與方法

一、主要儀器和試劑

SS?03AB型日光紫外線模擬器（UVA∶UVB=9∶1，上海希格瑪高技術有限公司），兔抗鼠IL?1β、TNF?α多克隆抗體（英國abcam公司），兔抗鼠IL?6多克隆抗體（美國Proteintech公司），IL?1β、IL?6、TNF?α DuosetELISA試劑盒（美國R&D systems公司），Heine手持式皮膚鏡（Delta20，德國漢尼光學儀器公司）。

二、實驗動物分組及處理

自美國JAKSON實驗室引進5～6周齡健康雄性SKH?1無毛小鼠［實驗動物許可證號：SCXK（滬）2015?0002］，體重25 g左右，上海市公共衛生中心動物中心負責繁育飼養于清潔級動物飼養室內，室溫20～24℃。根據文獻［6?7］，采用SS?03AB型日光紫外線模擬器在小鼠背部照射，最終確定小鼠背部皮膚紫外線最小紅斑量（minimalerythema dose，MED）為500mJ/cm2。

將50只小鼠隨機分為5組，每組10只。定制5種飼料（美國Dyets公司），n?3 PUFA占總脂肪酸的比例分別為0（對照組）、12.5%、25%、50%、100%，其余營養成分與正常實驗小鼠飼料相同，分別喂養5組小鼠。喂養至第50天，用4mm環鉆鉆取小鼠背部皮膚組織2塊，其中1塊放入4%甲醛溶液中固定，制作組織病理切片并行免疫組化檢查；另1塊組織用于制備組織勻漿檢測細胞因子。所有實驗小鼠接受單次照射，劑量為2MED。

紫外線照射后24 h觀察小鼠皮膚變化情況，留存大體照片和皮膚鏡照片，并用4mm環鉆取背部皮膚組織2塊，保存及后續實驗同照光前。

三、HE染色和曬傷細胞計數

組織標本HE染色，光鏡下觀察組織病理改變。兩名未參與本實驗的醫生在100倍視野下于每張切片上隨機選取10個不重疊視野，計數曬傷細胞（細胞體積變小、核固縮）［8］，計算每視野下曬傷細胞均值。

四、免疫組化SP法檢測IL?1β、IL?6、TNF?α表達

小鼠皮膚組織石蠟切片用兔抗鼠IL?1β、TNF?α、IL?6抗體行免疫組化SP法染色。用Image J圖像分析系統計算陽性表達（棕黃色染色區域）面積百分比。陰性對照用0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液代替一抗染色。

五、ELISA檢測組織中IL?1β、IL?6、TNF?α含量

將組織勻漿低溫離心（12 000 r/min，離心半徑2 cm）15min，提取上清液100 μl，測定IL?1β、IL?6、TNF?α含量，操作方法參照相關試劑盒說明書。

六、統計學方法

結 果

一、大體及皮膚鏡觀察結果

大體觀察結果見圖1。照光前小鼠皮膚正常，色澤均勻，未見任何損傷。紫外線照射后24 h，對照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠背部出現紅斑、明顯水腫、脫屑、抓痕等曬傷反應；25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅發現輕微紅腫，無脫屑及搔抓痕跡；100%n?3 PUFA組的小鼠皮膚紅腫不明顯。皮膚鏡觀察顯示，照光前小鼠皮膚可見皮紋、毛發、血管等正常結構，無特殊改變；紫外線照射后24 h，對照組小鼠皮膚可見明顯抓痕、大量鱗屑；12.5%n?3 PUFA組小鼠皮膚可見輕微抓痕；其他組小鼠皮膚均未見抓痕、鱗屑。

二、組織學觀察結果

見圖2。照光前小鼠皮膚組織結構完整，表皮、真皮及皮下組織層次清晰，表皮厚薄均勻。紫外線照射后24 h，對照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠表皮厚薄不均，細胞間水腫，炎細胞聚集，可見大量曬傷細胞；25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅見輕微表皮增厚，曬傷細胞較少；而100%n?3 PUFA組小鼠表皮未見明顯變化。見表1。

免疫組化結果顯示，照光前小鼠皮膚組織內無明顯炎癥相關因子（IL?1β、IL?6、TNF?α）表達。紫外線照射后24 h，小鼠表皮和真皮均不同程度表達IL?1β、IL?6、TNF?α；且n?3 PUFA含量越高，炎癥因子表達越少；對照組和12.5%n?3 PUFA組3種炎癥因子表達水平均高于25%、50%、100%n?3 PUFA組，差異均有統計學意義（P＜0.001），見表1、圖3。

三、皮膚組織勻漿中IL?1β、IL?6、TNF?α含量

ELISA檢測顯示，照光前3種炎癥因子含量極低，紫外線照射后24 h，各組小鼠炎癥因子表達明顯升高，且25%、50%和100%n?3 PUFA組小鼠皮膚組織中IL?1β含量低于對照組、12.5%n?3 PUFA組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。TNF?α和IL?6檢測結果與IL?1β組間變化趨勢類似。見表2。

討 論

紫外線是致皮炎、光老化和皮膚癌變的主要環境因子之一［9］。紫外線照射皮膚可產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使皮膚發生一系列光生物化學反應，引起皮膚急性光損傷［10］，臨床上可表現為皮膚血管擴張、紅斑、腫脹等；組織學改變包括細胞間水腫，毛細血管擴張，表皮出現“曬傷細胞”以及炎癥細胞浸潤等。從分子水平上看，在ROS刺激下，細胞中的各種磷脂酶活化，動員細胞膜上磷脂中花生四烯酸（AA，屬于n?6 PUFA）或二十碳五烯酸（EPA，屬于n?3 PUFA）等不飽和脂肪酸，在脂加氧酶（LOX）和環氧合酶（COX）作用下產生前列腺素（PG）、白三烯和血栓素A2等類二十烷酸，增加血管通透性、趨化中性粒細胞，從而調節IL?1β、IL?6、TNF?α等炎癥因子的產生［11?14］。

圖1 紫外線照射前后5組小鼠皮膚表現 照光前小鼠皮膚正常。紫外線照射后24 h，對照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠背部皮膚出現紅斑、明顯水腫、脫屑、抓痕等，25%、50%n?3 PUFA組小鼠僅發現輕微紅腫，100%n?3 PUFA組小鼠皮膚紅腫不明顯

圖2 紫外線照射前后5組小鼠皮膚組織病理改變（HE×100） 照光前小鼠背部皮膚組織結構完整，表皮厚薄均勻，表皮、真皮及皮下組織層次清晰。照光后對照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠表皮厚薄不均，細胞間水腫（紅色箭頭），曬傷細胞（黃色箭頭）、炎癥細胞聚集（黑色箭頭），25%和50%n?3 PUFA組可見輕微表皮增厚，曬傷細胞較少，100%n?3 PUFA組里未見明顯結構改變

表1 紫外線照射后24 h小鼠皮膚中曬傷細胞數量及不同炎癥細胞因子的表達（±s）

表1 紫外線照射后24 h小鼠皮膚中曬傷細胞數量及不同炎癥細胞因子的表達（±s）

注：a與對照組和12.5%n?3 PUFA組比較，P＜0.05；b與同列25%、50%、100%n?3 PUFA組相比，差異均有統計學意義，P＜0.001。PUFA：多不飽和脂肪酸

組別對照組12.5%n?3 PUFA組25%n?3 PUFA組50%n?3PUFA組100%n?3 PUFA組F值P值只數10 10 10 10 10曬傷細胞（個/100倍視野）17.50±4.93 14.25±1.71 6.50±1.73a 4.75±2.06a 4.50±1.73a 19.1＜0.001白細胞介素1β（%）9.90±0.75b 4.05±0.50b 3.98±0.49 1.31±0.20 0.84±0.10 175.8＜0.000 1白細胞介素6（%）12.25±0.52b 3.61±0.79b 2.42±0.23 1.04±0.13 0.71±0.24 332.6＜0.000 1腫瘤壞死因子α（%）4.96±0.21b 4.06±0.27b 1.43±0.47 1.08±0.12 0.79±0.16 145.7＜0.000 1

表2 ELISA檢測紫外線照射前后各組小鼠皮膚中炎癥因子表達水平（±s，ng/L）

表2 ELISA檢測紫外線照射前后各組小鼠皮膚中炎癥因子表達水平（±s，ng/L）

注：a與同列25%、50%、100%n?3PUFA組相比，P ＜0.05。PUFA：多不飽和脂肪酸

照光前照光后組別 只數對照組12.5%n?3 PUFA組25%n?3PUFA組50%n?3 PUFA組100%n?3 PUFA組F值P值10 10 10 10 10白細胞介素1β 112.30±24.74 72.36±12.02 75.96±9.22 69.80±21.93 58.73±19.76 2.931＞0.05白細胞介素6 104.80±5.65 94.80±36.16 82.30±26.16 115.80±32.07 67.80±16.97 1.458＞0.05腫瘤壞死因子α 92.06±12.35 84.15±40.44 71.90±11.45 94.70±45.43 66.86±12.10 0.398＞0.05白細胞介素1β 1962.44±451.78a 1276.67±531.54a 862.52±102.08 746.39±28.76 312.11±39.35 11.670＜0.001白細胞介素6 396.30±70.00a 373.80±67.55a 271.80±52.74 264.80±10.54 222.30±14.85 5.262＜0.05腫瘤壞死因子α 492.33±27.30a 547.67±63.31a 308.15±36.96 272.00±51.64 297.00±47.68 21.830＜0.000 1

圖3 紫外線照射前后不同炎癥細胞因子在5組小鼠皮膚中的表達（免疫組化染色×100）

既往人體實驗表明，膳食魚油能顯著增加免疫細胞膜磷脂中EPA、二十二碳六烯酸含量，使AA含量下降［15?16］，而且n?3 PUFA可通過與AA直接競爭，對脂加氧酶、環氧合酶作用或者影響酶活性來減少AA來源的PGE2和白三烯B4等類二十烷酸［17］，從而發揮抗炎作用。n?3 PUFA除了對系統性疾病如心血管疾病、結腸腫瘤等有一定防治作用，對皮膚最小紅斑量、長期紫外線照射所致皮膚光老化亦有一定影響。有研究表明攝入來自魚貝類等海洋來源的EPA、二十二碳六烯酸的受試者光老化程度較輕［4］。但是影響急性光損傷的具體劑量和保護作用之間的關系尚未見研究。

我們定制5種n?3 PUFA含量不同的小鼠飼料，分別喂養5組SKH?1無毛小鼠。該型小鼠皮膚裸露，同時又具有健全的免疫功能，類似于正常人體皮膚，便于紫外線照射和實驗觀察［7］。SS?03AB型日光紫外線模擬器發射的光線比較接近日光紫外線的組成，因此我們選擇其作為照射光源。本課題組前期研究發現［18］，小鼠膳食攝入n?3 PUFA第2周皮膚中n?3 PUFA包括α-亞麻酸、EPA和二十二碳六烯酸的含量即可顯著提高，但n?6 PUFA如AA、亞油酸的含量降低，這種變化在第4周趨于穩定。因而本研究在特殊喂養第50天進行急性光損傷造模，因1MED引起的小鼠皮膚紅腫反應不強，故采用2MED造模。在紫外線照射24 h后大體和皮膚鏡觀察均顯示對照組、12.5%n?3 PUFA組小鼠皮膚出現紅斑、水腫、脫屑、抓痕等，組織病理觀察到兩組小鼠表皮厚薄不均、細胞間水腫，可見曬傷細胞、大量炎癥細胞聚集等現象。該結果與胡堅等［7］研究結論相同，表明成功建立急性光損傷模型。25%、50%n?3 PUFA兩組照光小鼠僅見輕微紅腫、表皮增厚、細胞增生等，而100%n?3 PUFA組照光小鼠只觀察到輕微紅腫，且其表皮厚薄均勻，結構完整，層次清晰，與照光前小鼠的表現相似。表明n?3 PUFA對紫外線所致急性損傷有光保護作用。

本研究中免疫組化檢測還發現，紫外線照射后，各組IL?1β、IL?6、TNF?α在表皮或真皮中有不同程度表達；且隨n?3 PUFA含量升高，組織內3種因子的表達基本呈下降趨勢。ELISA檢測發現，與對照組、12.5%n?3 PUFA兩組相比，25%、50%、100%n?3 PUFA組IL?1β、IL?6、TNF?α含量降低。結合25%、50%、100%n?3 PUFA組小鼠皮膚損傷程度較輕，提示n?3 PUFA可能通過抑制上述炎癥因子產生，減輕急性光損傷。

以上結果表明，小鼠膳食中n?3 PUFA的比例達到25%時對紫外線所致的急性光損傷即可產生顯著防護作用，而且，比例越高，防護效果越顯著。這與一些研究證明飲食中n?6 PUFA/n?3 PUFA的比例不應超過4∶1結果一致［19］。但這些脂肪酸是否具有直接的紫外線防護作用尚需進一步研究。