空氣污染對皮膚角質層蛋白羰基化水平的影響及粉紅胡椒木提取物和脂質混合物對皮膚損傷的防護作用

江月明 趙小敏 瞿欣

200233上海，亞什蘭（中國）投資有限公司

角質層是機體抵御外界環(huán)境刺激的第一道屏障。環(huán)境污染物如顆粒物、紫外線和臭氧等侵害皮膚的重要機制是通過氧化損傷攻擊皮膚表層的不飽和脂質，破壞皮膚最外層的保護層，產生活性羰基類物質，如丙二醛、4-羥基壬烯醛、丙烯醛等。這類物質超過機體的清除能力即出現(xiàn)羰基應激，將誘導蛋白質等生物大分子的羰基化修飾，使其發(fā)生結構改變和功能喪失，從而加速皮膚衰老，或者引發(fā)皮膚的各種病態(tài)反應［1?3］。Iwai等［4?6］指出蛋白羰基化會損傷角質層的保水能力，影響皮膚透光率，改變皮膚的光學特性等。粉紅胡椒木提取物富含多酚類物質槲皮苷和半乳糖苷，有很強的抗氧化特性［7?10］，體外實驗證實其通過維持角質形成細胞活性，調控與表皮屏障相關的生物標記物來增強皮膚屏障功能預防空氣污染。脂質混合物（prolipid 141）主要成分為來源于植物的油水兩親分子物質，可在皮膚表層形成穩(wěn)定的仿生脂質的層狀凝膠相結構，物理性增加皮膚屏障功能，預防污染損傷［11?12］。我們利用定制的污染模擬箱，以香煙煙霧模擬污染物，建立污染損傷模型，以角質層蛋白羰基化水平表征皮膚的氧化損傷程度，在體評價粉紅胡椒木提取物和脂質混合物對皮膚損傷的預防作用。

材料與方法

1.試劑和儀器：定制的污染模擬箱（上海利捷科學儀器有限公司），Atlas SUNTESTCPS+日光模擬測試箱（德國Atlas公司），D500 D?Squame按壓器（美國Cuderm公司），D100 D?suqame膠片（美國Cuderm公司），熒光素-5-氨基硫脲（fluorescein?5?thiosemicarbazide，F(xiàn)TZ，上海阿拉丁試劑公司），Image?Pro Analyzer 7.0圖像分析軟件（美國Mediacybernetics公司），粉紅胡椒木提取物溶液（商品名為Elixiance，美國亞什蘭集團公司），脂質混合物（商品名為Prolipid 141，美國亞什蘭集團公司）。下文中提到的粉紅胡椒木提取物均為粉紅胡椒木提取物和丙二醇與水的混合溶液，脂質混合物為甘油硬脂酸酯、山俞醇、棕櫚酸、硬脂酸、月桂醇、肉豆蔻醇和鯨蠟醇混合物。

2.受試者：入選標準為18～65歲健康志愿者，以室內工作為主。排除標準：體質高度敏感或對香煙煙霧敏感者；有光敏感病史者；面部和手臂有皮膚疾病者；存在任何影響皮膚表面形態(tài)的行為者，如行表皮剝脫術或使用含維A酸、果酸等外用制劑；面部或前臂屈側有瘢痕、色素斑等影響結果判斷者。根據(jù)上述條件共入選受試者79名，年齡（44.7±11.0）歲，均為室內工作者，其中女性53名，年齡（44.1±10.5）歲；男性26名，年齡（45.9±12.2）歲。所有受試者均簽署知情同意書。以下所有人體測試均基于赫爾辛基宣言，且已經(jīng)通過美國亞什蘭公司毒理學部門的毒理學安全性審核。

3.人體不同部位蛋白羰基化水平檢測：健康受試者34名，年齡（40.1±11.1）歲，均為室內工作者。其中女性21名，年齡（40.5±11.4）歲；男性13名，年齡（39.5±11.1）歲。先通過預實驗確定D?squame膠片取樣量對蛋白羰基化水平的影響：選取其中4名受試者，在其額部、面頰部、前臂屈側和腰背部分別用兩種不同的壓力采集D?squame膠片，每個部位均獲得兩片取樣量差異較大的樣本，共計32片角質層樣本；精密天平稱量膠片采集前后的重量，差值即角質層重量，再對各樣品蛋白羰基化水平進行分析。分析顯示，角質層重量與蛋白羰基化水平相關性很低（R2=0.039 5），見圖1。因此，D?squame膠片取樣量對于比較不同部位蛋白羰基化水平的影響微弱。之后，分別在受試者額部、面頰、前臂屈側和腰背部采集皮膚角質層樣品，熒光標記分析不同部位蛋白羰基化水平。

4.人體污染暴露：定制的污染箱可以把微細顆粒或者香煙等污染物泵入密封的箱體內，并通過空氣循環(huán)對流使污染物在箱體里均勻分散。15名受試者，年齡（47.8±7.2）歲，均為室內工作者，其中女性12名，年齡（49.2±7.5）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。志愿者單側前臂用自來水內外沖洗各30 s，并于等候區(qū)［環(huán)境溫度（20±2）℃，相對濕度40%～60%］適應30min后，單側前臂屈側（含手掌）向上伸入污染模擬箱中暴露于以香煙煙霧模擬的空氣污染，確保暴露期間箱體內PM10和PM2.5濃度均大于1 000μg/m3（實驗監(jiān)測顯示，吸煙時面部附近顆粒物濃度可達1 200 μg/m3）［13］。分別于暴露后0、1、2、4、5 h用D?squame膠片采集前臂屈側角質層樣本，即用鑷子夾取D?squame膠片平整貼于前臂屈側手腕到手肘之間的皮膚，用D?Squame按壓器（225 g/cm2）按壓10 s后，撕取并封存于靜電貼膜中，置于-80℃冰箱保存。

5.粉紅胡椒木提取物和脂質混合物對皮膚損傷的短期預防作用：先通過預實驗確定角質層自體熒光和相鄰區(qū)域蛋白羰基化水平的差異，即在前臂屈側相鄰區(qū)域取2片表層角質層樣本，分別于熒光染色前后進行顯微鏡拍照分析，發(fā)現(xiàn)角質層自體熒光非常微弱，可以忽略不計。同時，相鄰區(qū)域皮膚的羰基化水平很接近，可以作為平行樣品對照。入選14名健康受試者，年齡（46.6±7.8）歲，均為室內工作者，其中女性11名，年齡（47.8±8.5）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。在每名受試者單側前臂屈側選取3處5 cm×5 cm區(qū)域，分別外用2mg/cm21%粉紅胡椒木提取物的水溶液（胡椒木組）、去離子水（對照組）或不涂任何樣品（空白組），并于等候區(qū)［環(huán)境溫度（20±2）℃，相對濕度40%～60%］適應15min后將手臂置于污染模擬箱中暴露5 h，期間嚴格監(jiān)控受試者以避免任何影響測試結果的行為，從而保證試驗的重復性。暴露前后采集各區(qū)域角質層樣本，檢測皮膚蛋白羰基化水平。另選16名健康受試者，年齡（42.2±10.6）歲，均為室內工作者，其中女性13名，年齡（42.2±11.8）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。單側前臂屈側選取3處5 cm×5 cm區(qū)域后，分別外用2mg/cm2含5%脂質混合物的乳液（脂質混合物組）、不含脂質混合物的安慰劑乳液（對照組）或不涂任何樣品（空白組）。暴露前和暴露5 h后采集各區(qū)域角質層樣本，用于檢測皮膚蛋白羰基化水平。

6.粉紅胡椒木提取物的長期預防作用：選擇上海市污染相對最嚴重的冬季（測試期間平均大氣污染指數(shù)AQI為105，PM2.5為98），健康受試者20名，年齡（53.9±7.7）歲，均為室內工作者，其中女性10名，年齡（52.6±5.7）歲；男性10名，年齡（55.2±9.5）歲。采用雙盲半臉測試，隨機選擇左右半臉分別外用含1%粉紅胡椒木提取物的自配乳液（主要成分為水、棕櫚酸異辛酯、乳木果油、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、PEG?100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、粉紅胡椒木提取物、丙烯酸/乙烯基吡咯烷酮交聯(lián)共聚物等）和不含粉紅胡椒木提取物的安慰劑乳液，均為每日早晚2次。受試者來訪第1天（未使用產品）和使用產品56 d后，采用D?Squame膠片在受試者的面頰部和額部分別采集角質層樣本，測定蛋白羰基化水平。

7.蛋白羰基化水平檢測［14］：將帶角質層樣本的D?squame膠片浸入40μmol/L熒光素-5-氨基硫脲溶液中，室溫置于暗處1 h。熒光染色后，取出膠片用PBS溶液沖洗3次，帶膠側朝上置于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并隨機選取3個視野拍攝照片（放大倍數(shù)：25和100；FTZ激發(fā)波長492 nm，入射波長516 nm）。采用Image Pro Plus 7.0軟件對25×圖像進行分析，僅選取熒光顯色區(qū)域，計算其平均熒光強度，以其代表蛋白羰基化水平。

圖2 身體不同部位蛋白羰基化水平（×100）綠色區(qū)域為熒光標記的角質層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

圖3 前臂屈側暴露于香煙煙霧不同時間后皮膚蛋白羰基化水平（×100） 綠色區(qū)域為熒光標記的角質層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

8.統(tǒng)計學方法：采用JMP10軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析多樣本間差異，兩樣本間做LSD?t檢驗。長期人體測試中左右面頰的蛋白羰基化水平比較采用配對樣本單尾t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.人體不同部位蛋白羰基化水平（平均熒光強度）：34名受試者面頰和額部高于手臂和腰背部，且熒光強弱的分布更不均勻，見圖2。面頰、額部、手臂和腰背部蛋白羰基化水平分別為26.3±7.1、22.9±7.9、14.7±4.9和12.6±4.2（F=37.768，P ＜0.001），手臂部顯著高于腰背部（t=2.031，P=0.046）。從科學性和可操作性綜合考慮，在之后的測試中，選用受試者前臂屈側暴露于污染模擬箱中。

2.污染暴露對皮膚蛋白羰基化水平的影響：15名受試者將前臂屈側暴露于香煙模擬的污染箱中后，隨暴露時間增加，蛋白羰基化水平持續(xù)增加，且與時間線性相關（R2=0.995 9），在暴露前和暴露1、2、4、5 h后分別為14.5± 3.67、20.2± 4.46、25.5±4.00、29.4±5.30和34.3±7.80，各時間點之間差異有統(tǒng)計學意義（F=17.278，P ＜0.001），見圖3。

圖4 粉紅胡椒木提取液對皮膚蛋白羰基化的抑制作用（×100） 綠色區(qū)域為熒光標記的角質層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

3.粉紅胡椒木提取物和脂質混合物對皮膚損傷的預防作用：短期的人體污染暴露實驗顯示，與空白組及對照組相比，胡椒木組香煙煙霧引起的皮膚損傷降低，見圖4。其中，胡椒木組（14名）暴露后角質層蛋白羰基化水平升高值為9.7±5.2，低于空白組和對照組（19.0±10.0、18.5±7.3，F(xiàn)=6.302，P=0.004），差異均具有統(tǒng)計學意義（t值分別為3.156、2.986，P值分別為0.001 5、0.002 4）。16名受試者5%脂質混合物乳液處理的區(qū)域暴露后角質層蛋白羰基化水平升高值為5.8±4.9，低于空白組和對照組（17.4± 8.8、15.9± 6.4，F(xiàn)=13.580，P ＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為4.792、4.170，均P＜0.001）。受試者試驗中未發(fā)生不良反應。

4.粉紅胡椒木提取物的長期預防作用：20名受試者與使用前相比，使用56 d后，面頰部提取物側和安慰劑側角質層蛋白羰基化水平變化值分別為-3.6±8.5和1.5±7.8，與安慰劑側相比，提取物側面部蛋白羰基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.156，P=0.022），14例受試者提取物側蛋白羰基化水平低于安慰劑側。受試者試驗中未發(fā)生不良反應。

討 論

隨著空氣污染日益成為公眾關注的焦點，越來越多的研究揭示空氣污染對皮膚的影響及其損傷機制［15?17］，但是鮮少提及具體的評價方法。歐萊雅（中國）有限公司的一項研究利用污染導致角質層不飽和脂質減少的機制，將高效液相色譜法測定的角鯊烯含量作為評價角質層脂質屏障受損的標記［18］。我們首次將角質層蛋白羰基化水平作為污染對皮膚損傷程度的標記物。盡管脂質屏障是最先遭到氧化損傷的對象，但是皮膚的修復機制可以抵御輕度的氧化損傷，持續(xù)過度的氧化損傷，才會進一步攻擊蛋白和DNA等［19］，進而引起外源性老化。因此，蛋白的羰基化修飾是皮膚更深層次的氧化損傷。相較于脂質屏障受損標記物角鯊烯，它能更準確全面地反映皮膚的損傷程度。但本研究未設相應標準對照，因而尚須進一步研究證實。蛋白羰基化水平作為衡量蛋白質氧化損傷的通用指標，有較多的測定方法，包括傳統(tǒng)的分光光度法、儀器分析法、Western印跡和酶聯(lián)免疫方法等［20］。我們采用一種直觀簡便的蛋白羰基化檢測方法，即通過膠帶剝離法采集樣本，并以熒光標記法結合Image?Pro Analyzer 7.0軟件分析D?squame膠片的熒光強度來表征角質層蛋白羰基化水平。傳統(tǒng)的分光光度法采用2,4-二硝基苯肼對角質層羰基化蛋白進行衍生化，需要毫克級蛋白且需經(jīng)多次沉淀、洗滌和復溶，不僅操作步驟繁瑣，而且容易造成蛋白損失［20］。本方法基于同等原理，通過熒光素-5-氨基硫脲的肼基與角質層蛋白的羰基結合進行標記，相比之下更簡便且能以圖像的形式直觀反映角質層的損傷程度［14］。

我們引入定制污染模擬箱，以香煙煙霧模擬空氣污染，在體評價污染對皮膚的損傷。由于污染模擬箱在皮膚損傷研究方面的應用較少，因而這類儀器尚待進一步標準化。香煙煙霧的組成類似于空氣污染中的化石燃料燃燒產物，且已被證實是室內PM污染的主要因素［21?22］。同時，香煙煙霧在呼吸道和心血管疾病方面表現(xiàn)出與空氣污染類似的健康風險［23］，以其作為模擬污染物具有一定的代表性。對污染模型的影響因素進行評估，證實角質層自體熒光對實驗無影響，且相鄰區(qū)域皮膚羰基化水平較為接近，因而在短期暴露測試中，將相鄰區(qū)域作為平行樣品的對照區(qū)域。人體不同部位由于在污染空氣和紫外線中暴露程度不同，羰基化水平也存在顯著性差異，面頰和額部為嚴重曝光部位，其蛋白羰基化水平最高，手臂為次級曝光部位，腰背部為非曝光部位，蛋白羰基化水平最低。人體長期曝光部位的蛋白羰基化水平更高是綜合因素作用的結果，空氣污染物協(xié)同紫外線可加劇皮膚的氧化損傷［24］。基于以上研究，利用該污染模型通過短期模擬加速暴露實驗評估粉紅胡椒木提取物和脂質混合物對皮膚損傷的預防作用，結果顯示，粉紅胡椒木提取物和脂質混合物組皮膚暴露后角質層蛋白羰基化水平升高值顯著低于空白組和對照組。同時，我們選擇污染嚴重的冬季，通過長期測試發(fā)現(xiàn)，受試者使用含1%粉紅胡椒木提取物的乳液8周后，面部蛋白羰基化水平顯著低于安慰劑側，進一步證實粉紅胡椒木提取物對皮膚損傷有持續(xù)預防作用。粉紅胡椒木提取物中富含的槲皮苷和半乳糖苷賦予其很強的抗氧化特性，可在短期污染暴露中即時減輕空氣污染物的氧化損傷，且在長期使用后，粉紅胡椒木提取物還可能通過調控與表皮屏障相關的生物標記物，如調節(jié)與皮膚代謝相關的非編碼RNA促進表皮分化［25?26］，同時促進緊密連接蛋白、鈣黏蛋白、內披蛋白、半胱天冬酶等標記物的表達來增強皮膚自身的屏障功能抵御空氣污染［27］。脂質混合物在生理溫度下可以模擬角質層脂質的有序層狀結構，同時其隨溫度變化的特性也和角質層脂質很接近［28］，因此外用含脂質混合物的乳霜后，可在皮膚表層鋪展形成穩(wěn)定的仿生脂質結構，從而物理性增強皮膚屏障，即時預防空氣污染損傷。

利益沖突聲明本試驗與亞什蘭（中國）投資有限公司存在利益關系。本研究中心隸屬于亞什蘭（中國）投資有限公司，實驗所有資源和資金均由亞什蘭（中國）投資有限公司提供