人纖維蛋白原抗體的檢測(cè)

閆晨 王強(qiáng) 堵疾 王文姬

【摘要】目的：根據(jù)人纖維蛋白原臨床實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)使用了一定量的人纖維蛋白原制品的病人血清中人纖維蛋白原有無(wú)抗體進(jìn)行測(cè)定。方法：參照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)CNAS-CL39等有關(guān)文件內(nèi)容要求，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，制定了此方案。使用了上海雙贏生物科技有限公司生產(chǎn)的人纖維蛋白原抗體酶聯(lián)免疫分析定性試劑盒，對(duì)精密度、診斷敏感性、特異性、同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)、CUTOFF值等各項(xiàng)參數(shù)在本實(shí)驗(yàn)室探究性地進(jìn)行研究。結(jié)論：1.精密度的試驗(yàn)：3個(gè)樣品連續(xù)檢測(cè)10次后的CV分別為9.30%、14.1%、13.6%判斷標(biāo)準(zhǔn)：CV小于15%，2.特異性實(shí)驗(yàn)：20份正常血清檢測(cè)結(jié)果計(jì)算符合率為100%。3.診斷敏感性的驗(yàn)證：取10份已知真陽(yáng)性的樣本用常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)陽(yáng)性的樣本占樣本總數(shù)的比例為100%。4.同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)，MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%-9.84%。TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%-7.04%。5.CUTOFF值連續(xù)統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比為0（小于50%判為合格）。

【關(guān)鍵詞】人纖維蛋白原；抗體；臨床實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)

1 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）表達(dá)。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中纖維蛋白原抗體（FIB Ab）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HIZP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原一抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HIZP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）的存在與否。

2 項(xiàng)目測(cè)定

精密度（Precision），診斷敏感性（sensitivity of diagnosis）、特異性（specificity）、同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)、CUTOFF值。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 （1）材料：人纖維蛋白原抗體（FIBAb）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（定性）；20份正常血清樣本；112份臨床使用了一定量的人纖維蛋白原制品的病人血清樣本；10份己知真陽(yáng)性的樣本。使用儀器：用MK3酶標(biāo)儀（已校驗(yàn)），TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀（已校驗(yàn)）。 （2）試驗(yàn)步驟：見(jiàn)人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（定性）說(shuō)明書(shū)。 （3）精密度的試驗(yàn)：同一份樣本在同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測(cè)10次.然后計(jì)算CV。

（4）特異性實(shí)驗(yàn)：20份正常血清檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算符合率。

（5）診斷敏感性的驗(yàn)證：取10份己知真陽(yáng)性的樣本，計(jì)算符合率。

（6）同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)。

（7）CUTOFF值：連續(xù)統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

人纖維蛋白原抗體（FIB AB）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，本試劑盒僅供研究使用。 （1）編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） （2）加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻， （3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

（5）洗滌：小L揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍千。

（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

（7）溫育：操作同30

（8）洗滌：操作同50

（9）顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色巧分鐘.

（10）終止：每孔加終止液501，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

（11）測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 精密度的試驗(yàn)

同一份樣本在同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測(cè)10次，然后計(jì)值，SD和CV.選取健康人血漿樣本3份（從正常人血清中隨機(jī)抽取），連續(xù)同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測(cè)10次，測(cè)得的結(jié)果如表2。

5.2 特異性實(shí)驗(yàn)：20份正常血清檢測(cè)結(jié)果計(jì)算符合率

陰性對(duì)照平均值≤0.10。20份正常血清檢測(cè)OD值均≤0.10。結(jié)果均陰性，陰性符合率100%。如表3。

5.3 診斷敏感性的試驗(yàn)

取10份己知真陽(yáng)性的樣本（樣本來(lái)源困難時(shí)可以酌情減少）。用常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)陽(yáng)性的樣本占樣本總數(shù)的比例。

從20批已檢測(cè)的正常血清中任選10批，正常血清：陽(yáng)性對(duì)照品=1：1的比例混勻，測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表3。10批陰性樣品的OD均值為0.018，臨界值為0.018+0.15=0.168.檢測(cè)結(jié)果均大于臨界值，故陽(yáng)性的合格率為100%。

5.4 同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)實(shí)驗(yàn)，用CV表示

表4與表5為相同樣品同一時(shí)間不同型號(hào)酶標(biāo)儀的檢測(cè)結(jié)果。MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%～9.84%。TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%～7.04%。

5.5 CUTOFF值連續(xù)統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間（共112個(gè)樣品）的檢測(cè)結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比例小于5%即可

對(duì)112個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，平均每個(gè)樣品檢測(cè)三次所得CUTOFF均值為0.031。臨界值為0.031+0.15=0.181.對(duì)照檢測(cè)結(jié)果處于臨界范圍的結(jié)果比例為0。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)與分析

計(jì)算和結(jié)果判定：

試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00；陰性對(duì)照平均值≤0.10。

臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15。

陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為纖維蛋白原抗體（FIB AB）陰性。

陽(yáng)性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為纖維蛋白原抗體（FIB AB）陽(yáng)性。 （1）精密度的試驗(yàn)：3個(gè)樣品連續(xù)檢測(cè)10次后的CV分別為9.3%，14.1%，13.6%判斷標(biāo)準(zhǔn)：CV小于15%， （2）特異性實(shí)驗(yàn)：20份正常血清檢測(cè)結(jié)果計(jì)算符合率為100%。 （3）診斷敏感性的驗(yàn)證：取10份己知真陽(yáng)性的樣本用常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)陽(yáng)性的樣本占樣本總數(shù)的比例為100%。

（4）同一項(xiàng)目不同儀器的比對(duì)，MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%～9.84%o TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%～7.04%。

（5）CUTOFF值驗(yàn)證連續(xù)統(tǒng)計(jì)一段時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比為0，小于5%。

7 標(biāo)本要求 （1）標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 （2）不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。 （3）操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

（4）試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

（5）濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

（6）封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

（7）底物請(qǐng)避光保存。

（8）試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm

（9）所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。