實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用研究

覃茂峰

我國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的成分有著嚴(yán)格的規(guī)定。當(dāng)下常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因作物類型有很多，但是都需要對(duì)這些作物進(jìn)行嚴(yán)格的基因檢測(cè)，才能流入市場(chǎng)。這就需要選擇合適的技術(shù)，能夠高效、快捷的加以應(yīng)用。目前的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)主要有以下三方面的內(nèi)容。首先是判定轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)；其次是對(duì)該作物品系的類型進(jìn)行檢測(cè)；最后就是對(duì)其中的含量進(jìn)行檢測(cè)。綜上，選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種最為有效的檢測(cè)手段。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)，要想了解其基因的拷貝數(shù)以及在特定組織中某些特定基因的表達(dá)量，那么就可以采用RT- PCR（RealTime PCR）技術(shù)。其基本原理是運(yùn)用擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中由循環(huán)產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)判定成分的。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要在熒光化學(xué)物質(zhì)的引導(dǎo)下，隨時(shí)觀察反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量，并且隨著產(chǎn)物數(shù)量的不斷增多，熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)隨之增強(qiáng)。在這一過(guò)程中，我們可以根據(jù)監(jiān)測(cè)物產(chǎn)量的變化，制定出一條實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖。這個(gè)曲線圖通常具有三個(gè)時(shí)期，第一時(shí)期為早期的背景擴(kuò)增時(shí)期，第二時(shí)期為中期階段的指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期，第三時(shí)期為晚期的平臺(tái)期。

在比較檢測(cè)樣本的過(guò)程中，需要設(shè)定一個(gè)閾值，這一閾值不是固定不變的，而是人為設(shè)定的一個(gè)數(shù)值。通常情況下，會(huì)設(shè)置3至15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是其標(biāo)準(zhǔn)差的10倍以上。每個(gè)模板都具有一個(gè)Ct值，這一數(shù)值與起始拷貝數(shù)息息相關(guān)，二者呈反比的關(guān)系。在實(shí)際檢測(cè)的過(guò)程中，如果我們知道了標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)，那么就可以根據(jù)相關(guān)信息制定出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而通過(guò)Ct值獲得樣品的起始拷貝數(shù)。

轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)的分析與結(jié)果

以轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆為例，選取適量的樣品與引物。本檢測(cè)中選擇來(lái)自巴西的轉(zhuǎn)基因大豆以及非轉(zhuǎn)基因大豆樣品。花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、胭脂堿合酶NOS終止子作為引物。對(duì)上述樣品進(jìn)行核酸的提取，將其置入核酸提取試劑盒中，分別采用CTAB法以及GMO試劑盒法對(duì)DNA進(jìn)行制備。

準(zhǔn)備階段完畢后，觀察PCR的反應(yīng)。分別要觀察常規(guī)PCR的反應(yīng)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)。在常規(guī)PCR檢測(cè)中，先對(duì)大豆樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在94℃的預(yù)變性環(huán)境下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，時(shí)間為3min；繼續(xù)在94℃的變性環(huán)境下持續(xù)20s，降低溫度至54℃，時(shí)間持續(xù)40s，進(jìn)而在72℃的溫度下延伸60s，最后持續(xù)3min完畢。對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)工具為2%的瓊脂糖凝膠電泳，作用是將非目的DNA片段以及緩沖溶液等不需要的雜質(zhì)去除干凈。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，PCR的反應(yīng)體系為25μL。其中包含反應(yīng)緩沖液5μmol/L，樣品核酸2μmol/L以及引物2μL等。具體的擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：在95℃的預(yù)變性環(huán)境下進(jìn)行循環(huán)，時(shí)間為10min。繼續(xù)在95℃的變性環(huán)境下持續(xù)10s，降低溫度至55℃，持續(xù)時(shí)間為8s，升溫至72℃，持續(xù)時(shí)間為10s。以上過(guò)程共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

將上述的兩種實(shí)驗(yàn)反應(yīng)制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為DNA初始濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為臨界循環(huán)值。上述兩種制備方法均得到了明顯的效果，都能從中提取出質(zhì)量較高的基因組DNA，并且觀察到大豆中的DNA無(wú)明顯差異。但是在熒光定量PCR中，臨界循環(huán)值具有明顯的重現(xiàn)性，可見(jiàn)其精準(zhǔn)度與常規(guī)檢測(cè)相比要高出很多。同時(shí)，經(jīng)過(guò)對(duì)靈敏度的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)中DNA的總量與檢測(cè)物基因組的大小直接影響著最終檢測(cè)靈敏度，也就是外源基因拷貝數(shù)。在特定的濃度標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行分析定量分析時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線中無(wú)明顯的引物二聚體變化，由此可以得到轉(zhuǎn)基因大豆在定量檢測(cè)過(guò)程中的最低限值。

雖然這一檢測(cè)技術(shù)在目前已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，但是還有一些問(wèn)題值得商榷，例如生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的不統(tǒng)一，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法進(jìn)行對(duì)比。又如分析靈敏度的精準(zhǔn)性不高等，都需要研究人員想辦法加以完善。只有不斷發(fā)現(xiàn)該技術(shù)中存在的不足，才能更好的應(yīng)用在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)以及其他領(lǐng)域的檢測(cè)活動(dòng)中。