肝豆靈片中黃連有效成分HPLC定性定量分析

陳莉　王盛　秦秀娟

摘要：目的 優化黃連有效成分的HPLC條件，建立肝豆靈片中黃連相關成分的定性定量分析方法。方法 采用HPLC對肝豆靈片中黃連的有效成分進行定性定量分析。流動相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節pH值為4.0），流速為1.0 mL/min，檢測波長為345 nm。結果 可以鑒別出黃連中表小檗堿、黃連堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀4個成分，且陰性對照無干擾；鹽酸小檗堿對照品進樣量在0.058～0.580 μg、鹽酸巴馬汀對照品進樣量在0.030～0.300 μg范圍內與吸收度峰面積值呈良好的線性關系，平均回收率分別為98.18%、99.99%，RSD分別為2.40%、1.70%。結論 本研究建立的方法操作簡便、準確、重復性好，可用于肝豆靈片的質量控制。

關鍵詞：肝豆靈片；黃連有效成分；高效液相色譜法；定性分析；定量分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0087-03

Qualitative and Quantitative Analysis of Active Components of Copditis Rhizoma in Gandouling Pills by HPLC

CHEN Li， WANG Sheng， QIN Xiu-juan， MENG Mei

The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM， State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China

Abstract： Objective To optimize the HPLC conditions for active components of Coptidis Rhizoma； To establish qualitative and quantitative analysis method for related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. Methods HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. With acetonitrile： 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution = 50：50 （per 100 mL was added 0.4 g sodium dodecyl sulfate， and then adjusted pH to 4.0 with phosphoric acid） as mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 345 nm. Results Four components of Coptidis Rhizoma can be identified， including berberine， coptisine， berberine hydrochloride and palmatine chloride， and the negative control had no disturbance. Berberine hydrochloride reference and the absorbance peak area value showed a good linear relationship within 0.058–0.580 μg sample volume， and palmatine chloride reference was the same within 0.030–0.300 μg sample volume. The average recovery was 98.18% and 99.99%， and RSD was 2.40% and 1.70%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and with good repeatability， which can be applied effectively to the quality control of Gandouling Pills.

Keywords： Gandouling Pills； active components of Coptidis Rhizoma； HPLC； qualitative analysis； quantitative analysis

作為國家重大疑難病防治中心和國家中醫藥管理局肝豆狀核變性協作組組長單位，安徽中醫藥大學第一附屬醫院腦病中心專家根據長期臨床實踐，認為痰瘀互結貫穿于該病始終，提出以化痰祛瘀為治法，總結出具有祛痰化瘀、軟堅散結功效的醫院制劑肝豆靈片（皖藥制字Z20050071），該制劑在臨床使用20余年，在改善肝豆狀核變性患者神經功能方面取得良好療效。為保證該制劑臨床使用的安全性和療效的穩定性，本研究建立方中臣藥黃連主要有效成分的HPLC測定方法，以有效控制本品質量。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（DAD紫外檢測器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置和自動進樣器），Analytical C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），超聲波清洗器（SK3200H，天津天有利科技有限公司），電子天平（Sartorius BP211D）。

肝豆靈片（批號20170609、20170310、20161024、20160703、20160318、20151123），安徽省中醫院制劑室；小檗堿對照品（批號110713-201212），中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，屈臣蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱取鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對照品適量，加甲醇制成每毫升含鹽酸小檗堿0.029 mg、鹽酸巴馬汀0.060 mg的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取本品粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用鹽酸-甲醇（1∶100）補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液

取缺黃連的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

采用Analytical C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節pH值為4.0），檢測波長345 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定。理論塔板數按小檗堿峰計算n=12 442，分離度R=3.18，拖尾因子T=0.99，均符合藥典規定。

2.3 黃連相關成分定性分析

分別吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測定，結果供試品色譜中依次出現4個含量較高的色譜峰（保留時間分別為14.119、1.639、18.767、20.888 min）。色譜圖見圖1。以小檗堿為參照，4個色譜峰的相對保留時間（見表1）與2015年版《中華人民共和國藥典》黃連項下含量測定項中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿保留時間規定值[1]的誤差均小于5%，符合要求。因此，可以初步驗證供試品色譜呈現的4個色譜峰分別為黃連相關成分表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿。1、2號峰保留時間分別與鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品溶液一致，且陰性對照無干擾，從而進一步驗證1、2、3、4號峰分別為小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿。

2.4 鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量測定

2.4.1 標準曲線的繪制

分別精密吸取0.029 mg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液2、4、6、8、16、20 μL，0.006 mg/mL鹽酸巴馬汀對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，分別以鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的進樣量為橫坐標，相應的峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的線性回歸方程分別為：Y=4139.522 4X+2.032 2，r=0.999 98；Y=4844.996 8X+7.030 8，r=0.999 96。結果鹽酸小檗堿對照品進樣量在0.058～0.580 μg、鹽酸巴馬汀對照品進樣量在0.030～0.300 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，連續進樣6次，測定峰面積積分值，結果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為0.33%、1.10%，表明本法精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗

取供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h進樣測定，結果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為0.23%、1.14%，表明供試品溶液中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀在10 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗

取樣品（批號20140307）6份，按含量測定項下方法制備并測定，結果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀RSD分別為2.36%、1.48%，表明本法重復性良好。

2.4.5 樣品的測定與含量限度的確定

取樣品，每批平行3份，分別按含量測定項下方法測定鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量，結果見表2。

2.4.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知鹽酸小檗堿含量的樣品（10.15 mg/g）適量，分別精密加入鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對照品適量，按含量測定項下方法制備供試品溶液并測定，結果見表3、表4。

3 討論

本研究建立了肝豆靈片中黃連相關成分HPLC定性定量分析方法，對制劑中黃連的4個成分表小檗堿、黃連堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀進行了定性分析，并對鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀進行了含量測定。

基于原國家食品藥品監督管理局《中藥制劑質量及穩定性研究技術指導原則》規定以檢測方中君臣藥、貴重藥和毒劇藥為主的原則，試驗初期設計將方中君藥姜黃的主要活性成分姜黃素作為含量測定項質控指標[2]，并對其HPLC含量測定條件進行摸索，結果供試品在與姜黃素對照品色譜峰相應的保留時間無對應峰出現，表明該成分在制劑中含量較低，故未采用姜黃素作為定量指標，而選用含量較高的臣藥黃連主要活性成分鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀作為含量測定指標[3]。制劑中君藥主要有效成分含量較低的原因及對整體藥效是否有影響，還需進一步探究。

HPLC測定鹽酸小檗堿的流動相體系較多。本試驗考察了3種流動相體系的色譜分離情況[1，4-7]：①乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節pH值為4.0）；②乙腈-三乙胺-冰醋酸-水；③乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL中加十二烷基磺酸鈉0.1 g）。結果供試品溶液以①為流動相，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與其他成分均能很好地分離，供試品色譜圖中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀保留時間與對照品一致，且陰性對照無干擾。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：304.

[2] 崔語涵，安瀟，王海峰，等.姜黃化學成分研究[J].中草藥，2016，47（7）：1074-1078.

[3] 杜慶波.黃連化學成分及藥理活性研究概況[J].包頭醫學院學報， 2015，31（5）：153-156.

[4] 王亞洲.小檗堿含量測定方法的研究進展[J].青島醫藥衛生，2013， 45（5）：359-361.

[5] 賴先榮，周邦華，杜明勝，等.6種黃連飲片中6種生物堿的RP-HPLC含量測定及與“治消渴”藥效學的譜-效關系分析[J].中國中藥雜志，2016， 41（24）：4579-4586.

[6] 高聰聰，許閩，周悌強，等.四方胃膠囊中鹽酸小檗堿的含量測定[J].中醫學報，2013，28（12）：1860-1861.

[7] 陸靜嫻，譚春梅，陳碧蓮，等.明目上清丸質量標準改進[J].藥物分析雜志，2016，36（11）：2051-2058.

（收稿日期：2017-09-25）

（修回日期：2018-01-02；編輯：陳靜）