表面增強拉曼光譜法定量檢測食品中香豆素

黃梅英等

摘要 建立了食品中香豆素的表面增強拉曼光譜定量分析法。以粒徑約為55 nm的金納米粒子為拉曼活性基底，以pH=5.0 HClKCl溶液為溶劑，釆用便攜式拉曼儀進行分析。通過實驗優化得到最佳測定條件（金納米溶膠濃縮倍數為50倍，激光照射時間為5 s，金納米溶膠與溶液的混合比例為1∶1），建立了食品中游離香豆素直接檢測方法，方法在1.0～100.0 mg/L的濃度范圍內具有良好的線性，檢出限為0.91 mg/L。將建立的分析方法用于蔬果、糖果、糕點等實際樣品中香豆素的檢測（樣品前處理過程：稱取10 g樣品于燒杯中，加入50 mL溶劑，超聲提取0.5 h后， 定容至100 mL，搖勻后過濾，取10 mL定容至100 mL，搖勻得到樣品處理液），香豆素含量在0.61～5.52 g/kg之間；樣品的加標回收率為75.12%～103.2%，相對標準偏差為0.6%～14%。結果表明， 本方法快速準確、操作簡單，可用于水果、糖果、糕點中香豆素的快速檢測。

關鍵詞；表面增強拉曼光譜；定量分析； 金納米粒子； 快速檢測； 香豆素； 食品。

1引言

香豆素（Coumarin）化學名稱為12苯并吡喃酮，在酸性條件下穩定存在，堿性條件下易開環。香豆素是一種天然植物次生產品，廣泛存在于自然界的一種內酯類化合物，具有高毒性，于1820年發現于黑香豆中，主要以游離狀態和苷的形式存在于植物中[1]。香豆素是一種重要的香料，被廣泛用作香料香精，也用作飲料、食品、香煙等的增香劑。常香蘭素作為調料共同用于糕點、糖果中，或作為天然香料添加到煙草中[2～6]。動物實驗證實香豆素具有致癌性，因此有些國家制定了攝取的安全劑量。歐洲理事會在1988年規定香豆素在食品中的限量為2 mg/kg，澳大利亞對酒精中香豆素的限量為10 mg/kg，歐洲食品安全局規定在食品中的添加限量在5～50 mg/kg之間[7，8]。

研究香豆素在體內的含量達到一定量時具有生理毒性，通過長期的動物實驗發現具有肝毒性[2]，主要是由于代謝的途徑導致P450（細胞色素P）及其依賴性酶的減少導致肝毒性。由于香豆素的潛在的不良反應，美國于2011年禁止在食品中添加由香豆屬類植物中提取的香豆素[9]。

目前，香豆素檢測方法有酶聯免疫法[10]高效液相色譜檢測[11～13]、液相色譜質譜聯用[14]、熒光光譜法[18～22]以及毛細管電泳法[23]等。酶聯免疫法只是診斷的輔助手段，易出現假陽性；色譜法和色譜質譜聯用法操作過程繁瑣、耗時長， 常用到有毒有害的有機溶劑；熒光光譜法干擾大、靈敏度較低；毛細管電泳法重現性差。因此，建立香豆素的方便快捷，選擇性高的檢測方法具有重要意義。近年來表面增強拉曼光譜（Surfaceenhanced raman spectroscopy， SERS）作為一種新型有效的指紋光譜技術，具有方便快速、檢測成本低、分析速度快、便攜性強等優點，在食品安全、毒品檢測領域顯示出巨大的應用潛力[24，25]。利用貴金屬納米粒子的SERS效應，可以將拉曼信號的靈敏度提高104～1014個數量級。本研究建立了食品中香豆素的表面增強拉曼光譜快速檢測分析方法， 與傳統檢測方法相比，本方法具有快速、靈敏、準確等特點，具有良好的應用前景。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Delta Nu Inspector便攜式拉曼儀（功率為120 MW， 美國DeltaNu公司）； A TG16離心機（湘儀儀器有限公司）； FA1604分析天平（上海天平儀器廠）； 攪拌器（Midea MJ250BP02A）； B廣泛試紙（114，上海三愛思試劑有限公司）； 超聲波清洗機（SCIENTZ SB5200D， 寧波新芝生物科技股份有限公司）。 金納米粒子溶液（由廈門大學提供，其濃度約為2.94×10

Symbolm@@ 4 mol/L，金納米粒子半徑約為55 nm）； HCl（分析純，36%～38%，廣州化學試劑二廠）； KCl（分析純， 廣州化學試劑）； 香豆素（阿拉丁試劑）； 王水（自配）； H2SO430%H2O2溶液（3∶1， V/V）； 純水（怡寶純凈水）。蘋果購于附近的水果市場； 西紅柿購于附近的菜市場、燕麥、糕點和糖果均購于超市。

2.2分析方法

2.2.1樣品制備標準溶液的配制：準確稱取0.1000 g香豆素標準品于燒杯中， 用HClKCl混合溶液（pH 5.0）溶解并定容至100 mL，得到1000 mg/L香豆素儲備液。取適量香豆素儲備液，用HClKCl混合溶液逐級稀釋成0.0 ， 1.0， 2.0， 5.0， 10， 20， 50， 100， 200， 300， 400和500 mg/L的標準工作溶液，密封、避光保存備用。

樣品處理：將樣品除去非食用部分后磨碎，準確稱取10 g樣品于燒杯中，加入50 mL HClKCl混合液，超聲浸泡0.5 h后，用HClKCl混合液定容至100 mL，搖勻后過濾，取10 mL濾液用HClKCl混合溶液定容至100 mL，搖勻后直接進行SERS檢測。

通過公式（1）計算出樣品的香豆素含量：

ω=CmV/ms（1）

ω為質量含量 （g/kg）， Cm為質量濃度 （g/L）， V為溶液體積（L）， ms為樣品量（kg）。

2.2.2SERS檢測取2.0 μL一定濃縮倍數的金納米粒子于硅片光滑面上，加入量香豆素標準溶液充分混合后，進行調焦后獲得拉曼光譜，并對數據進行處理。

以HClKCl混合溶液（pH 5.0）為溶劑，不同金納米粒子的濃縮倍數下進行檢測。金的濃縮倍數影響金納米粒子間的距離，影響物質與金納米粒子間的相互作用，會引起拉曼響應信號的變化。當濃縮倍數為50倍時，香豆素的SERS響應較好（圖3b），故濃縮倍數選擇50倍。

3.2.3激光照射時間

激光的作用是提供能量使分子獲得能量從而產生電子的躍遷，適當增加激光照射時間能夠提高能量，發生躍遷的電子增加，響應信號增強，但過長的照射時間會破壞分子的結構，因此需要在適當的時間下進行測定。在不同的激光照射時間進行香豆素的SERS檢測發現，激光照射時間對香豆素的SERS響應信號有較大影響，隨激光照射時間的延長，香豆素SERS信號呈現逐漸增強的趨勢，當照射時間過長，高濃度香豆素的拉曼響應信號容易溢出（圖4）。因此，激光照射時間選擇5 s。

3.2.4混合比例金納米粒子用量的增加使物質與金納米粒子結合更充分，拉曼響應信號有一定程度的增強，當金納米粒子用量增加到一定程度時， 可能會對物質形成比較厚的包裹層，降低物質拉曼信號的檢測。選擇合適的比例有利于物質的檢測。分別將待測液與金納米粒子以不同體積比混合均勻后檢測，1016 cm

Symbolm@@ 1處峰的強度呈現先增后減的趨勢，當體積比為1∶1時得到的峰面積最大，增強效果最明顯。因此，選擇待測液與金納米粒子的體積混合比例為1∶1作為最佳體積混合比，結果見圖5。

通過實驗條件的優化，選擇以為溶劑，濃縮倍數為50倍的金納米粒子為增強基底，激光照射時間為5 s，待測液與金納米粒子的體積比為1∶1作為香豆素檢測的最佳實驗條件。

選擇激發光光源波長為785 nm，積分時間為5 s，平等測定3次取平均值，激光功率High，測定模式為Software，分辨率選擇Low，每測定一次扣除一次暗電流。

3.3標準曲線

配制香豆素系列標準工作溶液，在優化的實驗條件下進行SERS檢測，結果見圖6。在1.0～100 mg/L范圍內，香豆素在1016 cm

Symbolm@@ 1處的拉曼光譜峰面積（y）與香豆素的質量濃度呈良好的線性關系，線性方程為y=1354+1945x，線性相關系數（R2）為0.9987。

對1.0 mg/L香豆素標準溶液測定15次，以3倍信噪比計算得到檢出限為0.91 mg/L。

蘋果、燕麥、西紅柿、1號糖果和2號糖果中香豆素含量分別為0.82， 0.80， 0.61， 5.52和1.51 g/kg，糕點中均未檢出1號糖果中香豆素含量超出標準，其樣品香豆素含量均符合標準（European Council， 1988，≤2.0 g/kg）＼[5＼]；樣品加標回收率為75.1%～103.2%，相對標準偏差RSD為0.6%～14.0%，表明方法準確度高，精密度好，結果可靠。

4結論

采用表面增強拉曼光譜法建立了食品中香豆素的定量檢測方法，方法在1.0～100.0 mg/L的濃度范圍內具有良好的線性，其線性相關系數為0.9987，檢出限為0.91 mg/L。蘋果、燕麥、西紅柿、1號糖果、2號糖果中香豆素的含量分別為0.82， 0.80， 0.61， 5.52和1.51 g/kg，兩種糕點樣品中未檢出，1號糖果香豆素含量超出標準（European Council， 1988， ≤2.0 g/kg），樣品回收率為75.1%～103.2%，相對標準偏差為為0.6%～14%。方法具有樣品用量少、成本低、環境友好、快速簡便等優點，適合于食品中香豆素快速檢測。

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AbstractA method was established for the determination of coumarin in various foods by surfaceenhanced Raman spectroscopy in a hydrochloric acidpotassium chloride solution （pH=5. 0） with 55 nm Au nanoparticles as Raman substrate. Under the optimal experiment conditions such as concentrated gold sol with concentration multiple of 50， 5 s of laser irradiation time and 1∶1 mixing ratio of gold sol and solution， the method was used for the direct determination of coumarin. The method had a good linearity between the peak intensity and the courmain concentration in the range of 1.00-100.0 mg/L， and the detection limit was 0.91 mg/L. For the determination of real samples of courmain in vegetables， fruits， sweets and pastries， 10 g of sample was added in 50 mL of hydrochloric acidpotassium chloride solution in a beaker， and then ultrasonically extracted for 0. 5 h. After transferred into a 100mL flask， the sample solution was filtered and 10 mL of supernatant was taken and diluted to 100 mL for the further analysis. The concentration of courmain was determined to be 0. 61-5.52 g/kg. The relative standard deviations were 0.6%-14.0%. The spiked recoveries of these samples ranged from 75.1% to 103.2%. This method is simple， and has wide linear range and high accuracy.

KeywordsSurfaceenhanced Raman spectroscopy； Quantitative analysis； Gold nanoparticles； Rapid detection； Coumarin； Foods

（Received 11 December 2014； accepted 12 April 2015）

This work was supported by the Major Scientific Instruments and Equipment Development Projects of China （No.2011YQ03012409） and the National Natural Science Foundation of China （Nos.21277176，21275168， 21127008）

中國化學會第二屆全國質譜分析學術報告會（第一輪通知）

為促進我國質譜分析及相關研究的快速發展，增進質譜研究與應用領域科技人員的學術交流與合作，由中國化學會及國家自然科學基金委主辦，中國化學會質譜分析專業委員會與浙江大學承辦的“中國化學會第二屆全國質譜分析學術報告會”將于2015年10月16日～19日在浙江大學紫金港校區召開。

本次會議將邀請多位院士和質譜專家參會并作特邀報告。會議熱誠邀請全國從事質譜研究與應用、及相關儀器研究與開發等領域的廣大學者、研究生、相關單位代表及儀器廠商參會。

一、征文內容：

應征的論文是未曾發表的質譜分析研究成果，涉及如下方面： 1 環境分析； 2 生命分析； 3 食品分析； 4 石油化工； 5 醫藥衛生； 6 公共安全； 7 天然物及煙草； 8 裂解機理、方法； 9 新材料、新能源； 10 樣品前處理方法； 11 儀器研制與新技術； 12 其它。

征集的論文將被分為大會報告、邀請報告、口頭報告和墻報四種形式交流。大會將設優秀青年報告獎和優秀墻報獎。

二、征文格式與要求：

1. 請在會議網站（http：//www.mschina.org/）下載論文模板，嚴格按論文模板編輯，在線注冊投稿。請務必提供稿件聯系人、電話、通訊地址和Email。

2. 論文提交截止日期為2015年8月15日。

三、會議聯系人

柴云峰，電話： 0571-87951285，Email： hplcms@zju.edu.cn

潘遠江，電話： 0571-87951629，Email： fticrms@zju.edu.cn

通訊地址：浙江大學玉泉校區化學系735室，310027。

有關會議的詳細介紹、組織機構、征文格式、日程安排、賓館住宿等相關信息，請登錄會議網址（http：//www.mschina.org/） 查詢。

中國化學會質譜分析專業委員會

浙江大學化學系