生物炭緩解甜瓜自毒物質(zhì)對木霉菌生長和產(chǎn)孢的抑制作用

范星菊，曲明星，譚磊，劉限

沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866

甜瓜（Cucumis melo）是重要的經(jīng)濟作物（王志丹等，2014）。然而，隨著甜瓜種植年限延長，土壤質(zhì)量逐漸惡化，如pH值降低、有機質(zhì)含量減少、氮磷含量降低（徐小軍等，2016）。甜瓜自毒物質(zhì)在土壤中逐年積累，引起土壤酶活性和微生物種群結構改變（病原菌增多而有益菌減少）（周艷麗等，2015），從而導致土壤的生產(chǎn)力下降，連作障礙嚴重，甜瓜枯萎病普遍發(fā)生，導致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重影響著瓜農(nóng)的收入（Seo et al.，2017）。目前，甜瓜枯萎病的防治主要采用化學藥劑防治，防治效果雖然較好，但容易造成土壤中致病菌的變異，從而增強致病菌對化學藥劑的抗性，降低甜瓜的品質(zhì)，同時也對環(huán)境造成很大的影響，威脅人類健康（唐琳等，2013；周小林等，2007）。因此，生物防治成為廣大學者普遍探討和追求的有機防治方法，其中木霉菌（Trichoderma sp.）是被廣泛應用的生防菌，但其防治效果不穩(wěn)定，易受環(huán)境因素的影響（陳捷等，2011；Gava et al.，2016）。目前關于甜瓜自毒物質(zhì)（主要是阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸）對木霉菌生長的影響少見報道，同時也缺乏如何緩解這些自毒物質(zhì)對木霉菌生長的研究。

生物炭是有機材料（木材、莊稼秸稈、有機廢物等）在高溫低氧條件下裂解形成的，具有較大的表面積、較高的pH值和較大電荷密度與表面負電荷等特點，同時具有較強的吸附能力（Lehmann et al.，2009）。其對土壤肥力的保持、田間持水量和陽離子交換量的提升等都有作用（陳紅霞等，2011；Steiner et al.，2008）。另外，生物炭在提高作物產(chǎn)量和病害防治上也有一定的作用（Biederman et al.，2013；Zwart et al.，2012；Jaiswal et al.，2014；Elmer et al.，2011）。因此，研究甜瓜自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響及生物炭對自毒物質(zhì)毒害的緩解作用，明確自毒物質(zhì)對木霉菌影響大小和木霉菌對自毒物質(zhì)毒害作用的差異，探明生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌毒害的作用效果，有助于提高木霉菌的生防效果，同時可為研制木霉菌多功能生防制劑提供理論支持，為甜瓜枯萎病的生物防治探索新的途徑，促進甜瓜生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種

本實驗室分離所得的木霉菌菌株 T23、T33、TSY1、TSY2、TFC1、TFC2、TFC3、TFC4，其中T23和T33是實驗室早期分離保留的木霉菌菌株，其余為2016年分離的不同地區(qū)的木霉菌菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取新鮮土豆進行削皮去污，稱量200 g土豆切片后放在蒸餾水水中煮沸，沸騰20 min左右在8層紗布下過濾，將過濾后的液體重新煮沸，并加入20 g葡萄糖和15～20 g瓊脂糖，不斷攪拌，待瓊脂完全溶解，將溶液定容至1000 mL，用250 mL錐形瓶分裝，于 121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌 30 min后備用。

含3%生物炭的PDA培養(yǎng)基：每100 mL PDA培養(yǎng)基中加入3 g生物炭。

1.1.3 試劑

生物炭粉劑：來自于玉米秸稈，有效成分（質(zhì)量分數(shù)）：8.83%有機碳、15.23%有機質(zhì)、0.72%速效鉀、0.0079%有效磷、0.0058%有效氮、61.1%灰分，pH=9.86，遼寧神農(nóng)佰奧生物質(zhì)科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)。自毒物質(zhì)：阿魏酸 FA（≥98%分析純）、肉桂酸CA（≥99.5%分析純）、苯甲酸BA（≥99.5%分析純）均為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 不同種類以及濃度的自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響

選取木霉菌菌株T23和TSY1，在含有不同濃度的 3種自毒物質(zhì)阿魏酸（FA）、苯甲酸（BA）、肉桂酸（CA）（0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5 mmol?L-1）的 PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，篩選出對木霉菌生長抑制作用明顯的自毒物質(zhì)濃度。在活化4 d 后的T23和TSY1木霉菌菌落邊緣，用打孔器取直徑為7 mm的菌片放入含有不同種類及濃度的自毒物質(zhì)培養(yǎng)基平板中，每處理平板中央各放置1片，以不加自毒物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理3個平行。于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天測菌落直徑，得出抑制率。7 d后用10 mL無菌水水洗孢子，稀釋后在血球計數(shù)板上計數(shù)，并計算自毒物質(zhì)對產(chǎn)孢的抑制率。

式中，Rinh為自毒物質(zhì)對產(chǎn)孢的抑制率；d0為對照處理木霉菌菌落直徑（產(chǎn)孢量）；d為自毒物質(zhì)處理木霉菌菌落直徑（產(chǎn)孢量）。

1.2.2 生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長、產(chǎn)孢的影響

于含自毒物質(zhì)PDA培養(yǎng)基（CK）和同時加入3%生物炭的培養(yǎng)基（CB）上，分別培養(yǎng)活化后的菌株 TFC1、TFC2、TFC3、TFC4、TSY1、TSY2、T23和T33，每平板中央處放置1片菌片，每組3個重復，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第 3天測量菌落直徑，7 d后用10 mL無菌水水洗孢子，稀釋后在血球計數(shù)板上計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用Duncan's新復極差法分析加入生物炭后自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響。采用t檢驗分析生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長和產(chǎn)孢的影響。

2 結果與分析

2.1 不同自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響

木霉菌在含有不同濃度以及種類甜瓜自毒物質(zhì)（阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸）中的 PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，木霉菌的生長狀態(tài)與培養(yǎng)形態(tài)均發(fā)生了變化，菌絲生長緩慢，菌落緊湊，都出現(xiàn)了生長受到抑制的現(xiàn)象，說明這些甜瓜自毒物質(zhì)都能影響木霉菌的生長。選取木霉菌T23和TSY1研究自毒物質(zhì)不同濃度對木霉菌生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)3種自毒物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度超過3 mmol?L-1時，對2種木霉菌的生長有強烈的抑制作用，抑制率都超過50%（表1）。

研究3 mmol?L-1阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸對不同木霉菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)不同自毒物質(zhì)對木霉菌生長有極顯著的影響。總體而言，阿魏酸對各種木霉菌的生長影響較大，顯著抑制了不同木霉菌的生長，苯甲酸抑制作用次之，肉桂酸抑制作用最小，但菌株TSY2的生長受肉桂酸影響較大，木霉菌菌落直徑較小（表2）。自毒物質(zhì)對不同木霉菌生長的抑制作用也存在極顯著差異，阿魏酸對木霉菌菌株TFC2和TFC3的抑制作用較弱，而對菌株TFC1和T23的抑制作用強；苯甲酸對菌株TFC3和TSY1的抑制作用較弱，而對菌株 TFC1和 T23的抑制作用強；肉桂酸對菌株TFC2、TFC3和 TFC4的抑制作用較弱，而對菌株TSY1和TFC1的抑制作用強。由此可知，不同木霉菌對自毒物質(zhì)的耐性（或抗性）是不同的，對3種自毒物質(zhì)耐性（抗性）有較強的菌株有TSY2、TFC2、TFC3，較弱的有TFC1和T23（表2）。

2.2 自毒物質(zhì)對木霉菌產(chǎn)孢的影響

除菌株FC3外，與對照相比，3種自毒物質(zhì)（3mmol?L-1）對木霉菌產(chǎn)孢的影響有極顯著差異，處理后各種木霉菌的產(chǎn)孢量顯著減少。總體而言，阿魏酸和苯甲酸對木霉菌產(chǎn)孢影響較大，而肉桂酸影響較小，但菌株 TSY2的產(chǎn)孢量受肉桂酸影響較大。自毒物質(zhì)對不同木霉菌產(chǎn)孢的抑制作用也存在極顯著差異，阿魏酸對木霉菌菌株TSY2和T33的抑制作用較弱，而對菌株TFC1、TFC54和T23的抑制作用強；苯甲酸能夠促進菌株T23產(chǎn)孢，對菌株TFC3的抑制作用也較弱，而對菌株TFC2和TSY1的抑制作用強；肉桂酸對菌株TFC3產(chǎn)孢沒有表現(xiàn)出抑制作用，對菌株TSY1的抑制作用強（表3）。由此可知，不同木霉菌產(chǎn)孢受自毒物質(zhì)的影響不同，且不同自毒物質(zhì)對不同木霉菌產(chǎn)孢的影響也存在差異。

表1 不同自毒物質(zhì)不同濃度下對木霉菌生長的抑制作用Table 1 Growth inhibition effects of different autotoxic substances on Trichoderma at different concentrations

表2 3 mmol?L-1不同自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響Table 2 Effects of different autotoxic substances on Trichoderma growth at 3 mmol?L-1

2.3 生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長、產(chǎn)孢的影響

在含自毒物質(zhì)的培養(yǎng)基中加入 3%生物炭后，木霉菌菌絲的生長速度和產(chǎn)孢量都發(fā)生了變化。含有生物炭的培養(yǎng)基上，木霉菌的生長速度顯著增長，與不加生物炭相比，菌落直徑極顯著增大（圖1）。大部分木霉菌菌株在加入生物炭后產(chǎn)孢量增加，緩解了自毒物質(zhì)對木霉菌產(chǎn)孢的影響。生物炭能夠緩解苯甲酸和肉桂酸對菌株 TFC1產(chǎn)孢的影響，顯著增加產(chǎn)孢量；也能夠緩解阿魏酸對菌株TFC2、TFC3、TSY1和T23產(chǎn)孢的影響，緩解肉桂酸對TFC4、TFC1和TSY1產(chǎn)孢的影響，緩解苯甲酸對T33和TFC1產(chǎn)孢的影響。但生物炭不能緩解肉桂酸對菌株TFC2和T33和阿魏酸對TSY2產(chǎn)孢的影響（圖2）。

表3 3 mmol?L-1不同自毒物質(zhì)對木霉菌產(chǎn)孢的影響Table 3 Effects of different autotoxic substances on Trichoderma sporulation at 3 mmol?L-1

3 討論

植物自毒物質(zhì)通過直接和間接作用影響土壤微生物的活動和種群結構，從而改變土壤環(huán)境，對自身和其他植物產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，草莓（Fragaria ananassa）自毒物質(zhì)阿魏酸和香豆酸對草莓炭疽病病原菌的生長表現(xiàn)出刺激作用（Tian et al.，2015），低濃度（50 mg?L-1）酚酸（苯甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和苯丙酸）對黃瓜（Cucumis sativus）枯萎病病原菌菌絲生長有刺激作用（胡元森等，2007），西瓜（Citrullus lanatus）根分泌物能顯著促進尖孢鐮刀菌的生長（Hao et al.，2010）。這些研究結果均說明，自毒物質(zhì)隨著連作年限的增加而在土壤中逐漸積累，導致有害微生物增加。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，松香酸的積累減少了辣椒（Capsicum frutescens）根際放線菌數(shù)量和微生物總量（周寶利等，2010）。飛機草（Chromolaena odorata）揮發(fā)油對真菌有明顯的抑制作用，且抑制作用隨揮發(fā)油濃度增加而增加（凌冰等，2003）。地黃（Rehmannia glutinosa）自毒物質(zhì)抑制了有益微生物的生長，刺激了病原微生物的生長，從而造成地黃自毒物質(zhì)的大量積累（杜家方等，2009）。本研究發(fā)現(xiàn)，不同自毒物質(zhì)對生防木霉菌的生長都有抑制作用，且不同木霉菌對不同自毒物質(zhì)的反應程度不同，說明不同木霉菌對自毒物質(zhì)的耐性（或抗性）不同，可以根據(jù)生產(chǎn)實際選擇耐性（或抗性）高的木霉菌菌株作為生防菌進行病害防治，從而提高甜瓜枯萎病的防治效果。有研究表明，這些自毒物質(zhì)在某些情況下還可以作為微生物的碳源或能源，增強微生物的活性（袁光林等，1998），因此在生防菌篩選過程中可以作為篩選指標來篩選能夠利用自毒物質(zhì)的生防菌，從而降低土壤中自毒物質(zhì)的含量，提高作物病害的防治效果。大部分木霉菌的產(chǎn)孢也受到了自毒物質(zhì)的抑制作用，但有的木霉菌在自毒物質(zhì)作用下的產(chǎn)孢量提高了，這說明自毒物質(zhì)對不同木霉菌的作用效果不同，這也為生防木霉菌的篩選提供了篩選參考。

圖1 生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長的影響Fig. 1 Amelioration effects of biochar on Trichoderma growth with different autotoxic substances

圖2 生物炭緩解自毒物質(zhì)對木霉菌產(chǎn)孢的影響Fig. 2 Amelioration effects of biochar on Trichoderma sporulation with different autotoxic substances

自毒物質(zhì)是作物連作障礙的主要原因，目前連作障礙的修復主要通過土壤生態(tài)修復技術來進行，主要包括農(nóng)業(yè)措施、土壤有益微生物增殖技術和土壤有機養(yǎng)分緩釋平衡技術，其中增施有機肥（菌肥）是被普遍采用的農(nóng)藝措施（Zhao et al.，2014）。也有研究通過接入外源物質(zhì)（如抗壞血酸）來緩解作物的自毒作用，提高植株的抗逆能力（馬彥霞等，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入生物炭能有效緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長和產(chǎn)孢的影響，說明生物炭在緩解自毒物質(zhì)毒害作用上是一種非常有效的物質(zhì)。生物炭進入土壤環(huán)境后，通過各種作用機制影響了微生物的生長代謝，還將改變微生物的生物地球化學功能，從而影響土壤環(huán)境中物質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化（張又弛等，2015）。生物炭通過其吸附作用、改善土壤理化性質(zhì)和提高土壤微生物活性去除土壤中殺蟲劑、除草劑等化學物質(zhì)（或降低這些化學物質(zhì)的生物活性）（Jablonowski et al.，2013；Zhang et al.，2018；Bielská et al.，2018）。Chen et al.（2012）也曾提出運用生物炭固定降解菌能夠增強土壤中多環(huán)芳烴的生物降解效率，從而達到修復土壤生態(tài)環(huán)境，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的效果。由此可知生物炭在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要作用，在實際應用中可以選擇生物炭作為木霉菌生防制劑的吸附劑，通過吸附作用降低自毒物質(zhì)對木霉菌的影響，同時生物炭還可以為木霉菌等有益微生物提供庇護所（Samonin et al.，2004），有利于有益微生物的生存，保持木霉菌生防效果的持續(xù)性，從而達到對甜瓜枯萎病防治的長久性。

4 結論

甜瓜自毒物質(zhì)對木霉菌生長和產(chǎn)孢都有一定的抑制作用（產(chǎn)孢上菌株TFC3除外），抑制效果表現(xiàn)為阿魏酸＞苯甲酸＞肉桂酸，在自毒物質(zhì)濃度為0.1 mmol?L-1時，抑制率超過 30%，在 3 mmol?L-1時，抑制率超過50%。秸稈生物炭（質(zhì)量分數(shù)為3%）能夠緩解自毒物質(zhì)對木霉菌生長和產(chǎn)孢的抑制作用，極顯著地促進木霉菌的生長，第3天菌落直徑基本與自毒物質(zhì)培養(yǎng)基處理相當，但對產(chǎn)孢的緩解作用，不同自毒物質(zhì)和不同木霉菌表現(xiàn)不同，有的表現(xiàn)為緩解作用，有的表現(xiàn)為抑制作用。