氮肥和多環(huán)芳烴對農(nóng)田土壤細(xì)菌群落的影響

戴葉亮 ，朱清禾，曾軍，鄭金偉，吳宇澄 *，林先貴

1. 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），江蘇 南京 210008；

2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境與科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所，江蘇 南京 210095；3. 湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，江蘇 南京 210008

自20世紀(jì)70年代以來，中國氮肥用量不斷增加（張衛(wèi)峰等，2013），至2011年，平均氮肥用量已達(dá)到180 kg?hm-2（以N計），比世界平均水平高75%（China Agricultural Yearbook Editing Committee，2011）。在太湖流域稻田，每年氮素綜合使用量高達(dá) 500～600 kg?hm-2（Zhao et al.，2012）。氮肥的過量施用產(chǎn)生了負(fù)面環(huán)境效應(yīng)，如溫室氣體排放（Pearson et al.，1993；Krupa，2003）、土壤酸化（周細(xì)紅等，2004）、板結(jié)和水體富營養(yǎng)化等（Bouwmeester et al.，1985），同時也可能導(dǎo)致土壤微生物群落組成與功能的改變（馬冬云等，2007）。氮肥可以直接刺激相關(guān)功能微生物的生長，如氨氧化細(xì)菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）、亞硝酸氧化細(xì)菌（Lisa et al.，2016）等。此外，過量施肥導(dǎo)致的土壤性質(zhì)變化作用于土壤微生物整體群落結(jié)構(gòu)，會產(chǎn)生更為深遠(yuǎn)的生態(tài)環(huán)境影響。

土壤污染是中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的另一重要威脅。多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是一類具有“三致”毒性的稠合苯環(huán)結(jié)構(gòu)有機(jī)物（周麗虹，2010），主要來自于煤、石油等化石燃料以及一些生物質(zhì)的不完全燃燒（傅家謨等，1996）。中國 PAHs年排放量達(dá) 11.4萬噸（Tao et al.，2009），土壤中PAHs的點位超標(biāo)率達(dá)到1.4%（環(huán)境保護(hù)部等，2014），個別點位每千克土壤含PAHs可達(dá)數(shù)萬微克（Wu et al.，2016）。多環(huán)芳烴對土壤生態(tài)系統(tǒng)具有廣泛的影響，如引起動植物死亡與突變（Staffan et al.，2007；Sverdrup et al.，2002），抑制植物生長（Maliszewska et al.，2000）等，并與微生物發(fā)生復(fù)雜的相互作用，影響微生物的多樣性、組成和生理功能（Sawulski et al.，2014；Demenezes et al.，2012），同時被微生物降解（Fuchs et al.，2011；吳宇澄等，2013）等。

受施肥和污染排放的影響，一些農(nóng)田土壤可能同時出現(xiàn)過量氮輸入和PAHs污染。盡管有關(guān)其各自的微生物效應(yīng)已有不少報道，但對兩者疊加情況下的土壤微生物群落響應(yīng)仍缺乏研究。本研究分別選擇尿素和苯并[a]蒽（benz[a]anthracene，BaA）為氮肥和PAHs的代表，模擬土壤中過量施用尿素以及高濃度的BaA污染，設(shè)置土壤微宇宙試驗，在測定尿素和苯并[a]蒽轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，采用高通量測序和定量 PCR方法深入解析添加污染物及施肥之后土壤細(xì)菌群落的豐度、多樣性以及組成變化，結(jié)果有助于闡明農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴和銨態(tài)氮肥的復(fù)合效應(yīng)，并為探究有機(jī)污染物和氮轉(zhuǎn)化間的交互作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣于2016年4月進(jìn)行。供試土壤采自南京市郊某冶金企業(yè)附近的蔬菜地，采用五點采樣法采集土樣后充分混勻為1個混合土樣，基本理化性質(zhì)為：pH 6.5，有機(jī)質(zhì)2.47%，總氮1.39 g?kg-1，銨態(tài)氮 5.8 mg?kg-1，硝態(tài)氮 6.4 mg?kg-1，15 種優(yōu)控 PAHs總量922 μg?kg-1。土樣經(jīng)風(fēng)干磨細(xì)后用于微宇宙培養(yǎng)試驗。

1.2 微宇宙試驗

微宇宙試驗：120 mL血清瓶中裝入30 g土壤（干質(zhì)量），調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的60%，于黑暗的環(huán)境中（28 ℃）培養(yǎng)。共設(shè)置4個處理：對照處理（CK）、只添加苯并[a]蒽（A）、只添加尿素（N）、添加苯并[a]蒽和尿素（NA）。苯并[a]蒽和尿素的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100 mg?kg-1和56 mg?kg-1，在培養(yǎng)的第28天和第56天補(bǔ)充等N量的尿素。每個處理設(shè)置9個重復(fù)，在培養(yǎng)的第28天、第56天以及第84天進(jìn)行破壞性取樣（每個處理每次各 3個）。土壤經(jīng)處理后，一部分用于 pH及無機(jī)氮測定，一部分提取DNA后用于下游分子生態(tài)分析。

同時設(shè)置一組平行土壤微宇宙試驗，通過測定[7,12-14C]苯并[a]蒽（American Radiolabeled Chemicals，Inc.）的礦化量表征污染物的轉(zhuǎn)化率。設(shè)置2個處理：只添加苯并[a]蒽（A），同時添加尿素和苯并[a]蒽（NA），其中苯并[a]蒽為14C和未標(biāo)記的苯并[a]蒽混合物，土壤中污染物和尿素的終濃度及含水量同上所述，[7,12-14C]苯并[a]蒽添加量為2.2×105dpi?g-1，每個處理設(shè)置 3個平行。

1.3 土壤pH和硝態(tài)氮的測定

采用酸度計測定土壤 pH（水土比 5∶1）；用 2 mol?L-1KCl溶液提取土壤無機(jī)氮，用VCl3將硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮后，采用Griess試劑法測定（Wu et al.，2013）。

1.4 多環(huán)芳烴礦化量測定

以1 mol·L-1NaOH溶液吸收CO2，采用液體閃爍計數(shù)法（Beckman-Coulter，USA）（Wang et al.，2017）測定14CO2量。每兩周取樣測試1次。

1.5 土壤DNA提取

采用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals）提取土壤 DNA，微量分光光度計（NanoDrop 2000）和電泳法檢測DNA的質(zhì)量。為避免共提取的土壤腐殖質(zhì)等雜質(zhì)干擾 PCR反應(yīng)，DNA提取液經(jīng)10倍稀釋后用于下游分析。

1.6 硝化微生物功能基因定量PCR分析

參照文獻(xiàn)方法（Cebron et al.，2008），采用定量 PCR方法測定各樣品細(xì)菌和古菌單加氧酶基因（amoA）的拷貝數(shù)。定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：克隆目標(biāo)基因提取質(zhì)粒后測定其濃度并計算拷貝數(shù)，進(jìn)行梯度稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（拷貝數(shù)范圍102～108μL-1），定量 PCR 曲線標(biāo)準(zhǔn) R2＞0.99，擴(kuò)增效率≥80%。

定量PCR采用Sybr Green方法。總反應(yīng)體積為 20 μL，包含 10 μL TransStart Green qPCR SuperMix（全式金），2 μL土壤DNA和8 pmol引物。古菌amoA基因（引物序列：5’-ATG GTC TGG YTW AGA CG -3’和 5’-GCC ATC CAB CKR TAN GTC CA-3’）反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s并讀取熒光信號，38個循環(huán)；細(xì)菌amoA基因（引物序列：5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3′和 5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC-3′）反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 45 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 30 s并讀取熒光信號，36個循環(huán)。隨后進(jìn)行熔解曲線分析，采用電泳分析評價其擴(kuò)增單一性。

1.7 細(xì)菌16S rRNA基因高通量測序及數(shù)據(jù)分析

采用通用引物 519F和 907R（引物序列：5′-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3′5′-TTACGACTT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因片段，其中正向引物序列中包含 5 bp的條形碼（barcode）序列。PCR反應(yīng)體積為50 μL，包括25 μL Taq DNA聚合酶預(yù)混液（Takara），1 μL模板（約50 ng基因組 DNA），1 μL正向及反向引物，23 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件為 95 ℃ 3 min，95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后構(gòu)建測序文庫，采用Illumina MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行雙向高通量測序（上海美吉）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

基于QIIME分析平臺進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)分析。序列經(jīng)拼接、比對后在97%相似性水平劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），以此為基礎(chǔ)計算多樣性指數(shù)和非度量多維尺度分析（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）。運(yùn)用R軟件（vegan數(shù)據(jù)包）計算細(xì)菌群落之間的布雷距離（Bray distance），采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和多重比較，用Graphpad Prism 5作圖。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤硝化和污染物礦化

隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，4個處理微宇宙試驗都出現(xiàn)明顯的 NO3--N積累（圖 1A）。兩個添加尿素的處理（N和NA）硝態(tài)氮上升幅度更大，pH降低約1個單位，提示土壤硝化導(dǎo)致土壤酸化（圖1B）。在84 d時，NA處理相對于N處理硝態(tài)氮增加緩慢，同時加入BaA（A和NA）處理相對于不加的處理（CK和N）土壤pH下降幅度有所減小。

培養(yǎng)過程中，14CO2持續(xù)積累，84 d礦化量約為10%（圖1C）。添加尿素與否對土壤中BaA的礦化沒有顯著影響。

2.2 硝化微生物功能基因豐度

定量PCR檢測中，硝化微生物功能基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線分析和電泳分析為單一峰（條帶），表明擴(kuò)增不受引物二聚體或者非特異擴(kuò)增影響。所有處理中，細(xì)菌 amoA基因拷貝數(shù)為1.2×107～5.6×107copies·g-1，古菌 amoA 基因拷貝數(shù)為 3.0×106～1.3×107copies·g-1。

不添加尿素的CK和A處理中，細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)無顯著變化，N處理在28 d時顯著升高而后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，NA處理在28 d和56 d持續(xù)升高，但在84 d大幅度下降（圖2A）。在N和CK處理中，古菌amoA基因拷貝數(shù)未發(fā)生顯著變化；但添加BaA后，雖然NA處理中AOA數(shù)量在28 d有所增加，但是到56 d和84 d后，NA和A處理中古菌amoA基因拷貝數(shù)顯著降低，其中84 d NA處理中AOA的數(shù)量相比于CK，降低了63%。（圖2B）。

2.3 土壤細(xì)菌多樣性變化

Miseq測序中，38個樣品一共獲得962536條16S rRNA基因序列，單個樣品的序列數(shù)為17795～38255，在 97%序列相似性水平獲得 5236個OTU。每個樣品隨機(jī)抽樣17700條做OTU表，在此基礎(chǔ)上分析土壤細(xì)菌的群落組成與多樣性。

與原始土壤相比較，84 d的培養(yǎng)導(dǎo)致CK處理中細(xì)菌多樣性明顯降低，BaA的加入則未對土壤微生物多樣性指數(shù)產(chǎn)生影響。添加尿素的處理中，土壤細(xì)菌群落多樣性顯著下降，在培養(yǎng)84 d時下降趨勢尤為明顯，Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)等均顯著降低（圖3）。

圖1 微宇宙培養(yǎng)過程中土壤量（A）、pH（B）以及苯并[a]蒽礦化率（C）的變化Fig. 1 Changes in NO3- (A), soil pH (B) and mineralization of benz[a]anthracene (C) during the incubation n=3

圖2 培養(yǎng)過程中細(xì)菌（A）和古菌amoA基因（B）豐度的變化Fig. 2 Changes in the bacterial (A) and archaeal amoA gene copies (B) during the incubation

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。NMDS分析（圖4A）顯示：28 d時，各處理土壤細(xì)菌群落相對聚集，未有明顯區(qū)分；56 d起，添加尿素處理與不添加尿素處理形成了不同的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，N和NA處理與A和CK處理群落之間差異明顯，但BaA對群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小；84 d時，細(xì)菌群落間的差異進(jìn)一步增大。統(tǒng)計分析顯示（圖4B），培養(yǎng)28 d時，A、N及NA 3個處理與CK之間未有顯著變化，到58 d加尿素處理中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)與CK顯著不同，而84 d時，各處理中細(xì)菌群落都有極顯著變化且尿素的影響大于BaA。

在綱（Class）分類水平，土壤中相對豐度≥1%的主要細(xì)菌門類有14個（表1）。在此14個綱中，6個綱的相對豐度和土壤pH呈正相關(guān)關(guān)系，其中2個為顯著相關(guān)，4個為極顯著相關(guān)；4個綱和土壤pH均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，添加尿素顯著增加了和土壤亞硝酸氧化相關(guān)的Nitrospirae的豐度（數(shù)據(jù)未顯示）。這些結(jié)果表明，尿素很可能促進(jìn)了相關(guān)的硝化微生物生長，但是土壤中細(xì)菌群落的整體變化則可能主要由尿素導(dǎo)致的pH變化引起。

表1 綱水平土壤細(xì)菌相對豐度和pH之間相關(guān)性分析Table 1 Correlation between dominant bacterial class and soil pH

圖3 培養(yǎng)過程中土壤多樣性指數(shù)變化：Chao1指數(shù)（A）、觀測到的物種數(shù)（B）、香農(nóng)指數(shù)（C）Fig. 3 Change of soil diversity index: Chao 1 (A), Observed species (B), Shannon (C)

圖4 土壤細(xì)菌群落間的NMDS（A）和布雷距離分析（B）Fig. 4 NMDS (A) and bray_distance (B) analysis of soil bacteria communities

3 討論

3.1 尿素的微生物生態(tài)效應(yīng)

大量研究發(fā)現(xiàn)，使用銨態(tài)氮肥會出現(xiàn)明顯的硝酸鹽積累同時顯著降低土壤pH（Phillip et al.，1997；Bouman et al.，1995；Dlana et al.，2008）。本研究中，添加尿素處理中出現(xiàn)的此類現(xiàn)象，究其原因為底物刺激導(dǎo)致的土壤硝化活性增加。硝化過程由氨氧化和亞硝酸氧化兩個步驟組成，其中氨氧化過程主要由氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌完成（Lisa et al.，2016），它們受到土壤pH值的強(qiáng)烈影響（He et al.，2012）。由于供試土壤為中性，氨分子濃度較高，有利于氨氧化細(xì)菌的生長，反映為相應(yīng)微宇宙中細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)的增加；在此環(huán)境下，氨氧化古菌可能居于競爭劣勢（Zhang et al.，2012），而未出現(xiàn)明顯增殖。

土壤pH直接影響著微生物的多樣性和組成結(jié)構(gòu)（Wu et al.，2016；Kateryna et al.，2015；Lauber et al.，2009）。在本研究中，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，尤其是56 d之后，添加尿素微宇宙土壤的pH明顯降低，對土壤微生物群落產(chǎn)生了巨大的影響。一方面，這可能導(dǎo)致了培養(yǎng)后期硝化微生物豐度的降低（圖2），另一方面改變了土壤中的優(yōu)勢微生物（表1）、降低了土壤微生物的多樣性（圖3），并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌群落的整體變化（圖4）。土壤酸化不僅影響微生物，還會導(dǎo)致土壤有毒重金屬離子活性增加、土壤肥力降低、結(jié)構(gòu)變差以及影響作物生長發(fā)育等一系列問題（Sutradhar et al.，2014；Baquy et al.，2017；Lofton et al.，2010）。本研究所模擬的施氮量與目前太湖流域部分稻田的綜合施肥量相近（Zhao et al.，2012），因此，過量施用氮肥導(dǎo)致的土壤生態(tài)風(fēng)險不可忽視。

3.2 苯并[a]蒽的微生物生態(tài)效應(yīng)

有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的多環(huán)芳烴污染能顯著改變土壤微生物的多樣性（吳宇澄等，2016）、群落組成和生理活性（Sawulski et al.，2014；Demenezes et al.，2012）。對本研究采樣區(qū)的原位調(diào)查結(jié)果顯示（Wu et al.，2016；Wu et al.，2017），與 PAHs污染相比，pH是更重要的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)決定因素。本研究通過微宇宙培養(yǎng)所獲得的結(jié)果與原位調(diào)查相似，初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 100 mg?kg-1的 BaA對土壤微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小。分析其原因，可能是由于BaA的礦化率只有10%左右（圖1C），更多的污染物還是以各種形態(tài)存在于土壤中，而BaA是一種疏水性污染物，與土壤基質(zhì)發(fā)生結(jié)合后，生物有效性降低。但是，長期PAHs作用的微生物群落效應(yīng)依然存在。本研究中，84 d時CK與A處理下的細(xì)菌群落產(chǎn)生了較明顯的分離（圖4）。雖然目前這種改變的機(jī)制尚不清楚，但有文獻(xiàn)報道，PAHs對微生物具有選擇性（吳宇澄等，2016），導(dǎo)致降解功能細(xì)菌的富集與敏感細(xì)菌的下降（Cebron et al.，2008；Chen et al.，2015；Bengtsson et al.，2013）；此外，許多PAHs降解的中間產(chǎn)物可能具有更高的生物毒性（Staffan et al.，2007），如我們發(fā)現(xiàn)BaA的降解中間產(chǎn)物苯并[a]蒽醌對一類氨氧化古菌有更強(qiáng)的抑制效果（Dai et al.，2018），這些中間產(chǎn)物也會形成一定的生態(tài)風(fēng)險。考慮到 PAHs類污染物種類的多樣與土壤的復(fù)雜性，需進(jìn)一步探究PAHs的土壤微生物生態(tài)效應(yīng)。

3.3 尿素和苯并[a]蒽對土壤微生物的交互作用

尿素和苯并[a]蒽的轉(zhuǎn)化均是微生物作用的結(jié)果。土壤中氮循環(huán)和污染物降解過程是否存在相互作用，是污染生態(tài)學(xué)和污染土壤修復(fù)研究關(guān)注的重要科學(xué)問題。CO2是PAHs轉(zhuǎn)化的最終形態(tài)，是污染土壤修復(fù)的最理想狀態(tài)，礦化率是土壤中 PAHs修復(fù)效果的重要指標(biāo)。一般而言，PAHs礦化率越高，表明解毒效果越好。本研究中，添加尿素未對BaA的礦化率產(chǎn)生顯著影響。分析其原因，可能是由于供試土壤本身的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征導(dǎo)致尿素或者硝化過程對 BaA的礦化影響本身就較小（K?stner et al.，1998）。但有研究發(fā)現(xiàn)，弱酸能夠顯著促進(jìn)土壤中 PAHs的礦化（Bhabananda et al.，2017），硝化微生物（AOA）具有降解芳香性污染物的能力（Men et al.，2016）。在不同的土壤中，由于受微生物群落、土壤化學(xué)性質(zhì)、物理結(jié)構(gòu)以及尿素和 PAHs的濃度等因素影響，尿素是否影響PAHs的礦化還有待更深入的研究。

此外，供試土壤有較長的PAHs污染歷史（Wu et al.，2016），這可能導(dǎo)致土壤硝化微生物產(chǎn)生抗性從而產(chǎn)生適應(yīng)性（Griffiths et al.，2013），故添加BaA后，本研究未像其他研究（Cheng et al.，2014）一樣出現(xiàn)土壤硝化活性的顯著降低。但是，100 mg?kg-1的BaA顯著降低了土壤中古菌amoA基因拷貝數(shù)，并減緩了土壤硝化過程伴隨的土壤酸化。由此推測，BaA可能對土壤中尿素的硝化產(chǎn)生影響，這與我們此前觀察到PAHs對氨氧化古菌的抑制效應(yīng)一致。

4 結(jié)論

本研究探究了尿素和苯并[a]蒽對農(nóng)田土壤微生物群落的生態(tài)效應(yīng)。結(jié)果顯示，尿素顯著刺激土壤硝化活性和硝化細(xì)菌生長，降低土壤 pH，并通過土壤酸化對微生物群落產(chǎn)生極大影響；苯并[a]蒽有抑制土壤硝化、改變土壤微生物組成和結(jié)構(gòu)的潛在趨勢，但作用相對較小；受試土壤中，尿素雖未抑制苯并[a]蒽的礦化，但苯并[a]蒽抑制了土壤中硝化古菌的生長，且減緩了硝化過程伴隨的土壤pH降低。鑒于土壤間存在的理化性質(zhì)和微生物群落差異，還需更深入地研究施肥和有機(jī)污染物的土壤生態(tài)效應(yīng)及其相互作用。

致謝：感謝南京大學(xué)季榮教授對于本研究中多環(huán)芳烴礦化分析的大力支持！