阿魏酸類化合物對銅綠微囊藻的化感作用及富里酸對化感作用的影響

楊萌 ，劉喆 ，楊笑宇 ，艾思敏 ，王冬梅，劉立明*

1. 湖北省三峽地區生態保護與治理國際聯合研究中心，三峽大學，湖北 宜昌 443002；

2. 三峽庫區生態環境教育部工程研究中心，三峽大學，湖北 宜昌 443002；3. 湖北景深安全技術有限公司，湖北 宜昌 443002

關于水華藻類的控制目前主要有物理方法、化學方法和生物方法，其中植物化感作用是生物方法之一（Hu et al.，2008），相關研究已受到國內外學者的關注（王紅強等，2017；Hong et al.，2011）。化感作用最早由奧地利科學家Molisch提出（Willis，2007），描述為某種植物分泌生物化學物質抑制周圍其他植物的生長（Reigosa et al.，2006）；后來Rice（1984）在《化感作用》專著中擴大了該定義：一種植物通過釋放到自然環境中的生化物質對另一種植物或者微生物所造成的正面或負面的影響。

研究表明，水生植物對藻類生長有抑制作用，例如蘆葦（Phragmites communis）（李鋒民等，2007）、普生輪藻（Chara vulgaris）（何宗祥等，2014）、鳳眼蓮（Eichharnia crassipes）（Elsheekh et al.，2017）、穗狀狐尾藻（Myriophyllum spicatum）（He et al.，2016）、石菖蒲（Acorus tatarinowii）（Nakai et al.，2010）、水花生（Alternanthera philoxeroides）（Zuo et al.，2012）、輪藻（Chara vulgaris）（Rojo et al.，2017）、菹草（Potamogeton crispus）（賀鋒等，2002）、苦草（Vallisneria spiralis）（高云霓等，2011）等。利用農作物的秸稈也可以控制藻類，其中大麥桿已經有成功應用實例。1994年美國水生植物管理中心將50 g?m-3的大麥秸稈直接投入富營養化水體中抑制藻類，并取得了成功（Everall et al.，1997）；英國德貝郡的一個55000 m3的水域利用大麥秸稈控制藻類，發現其水質明顯得到改善，水體中的物種構成也發生了變化（Everall et al.，1996）。在已發現的植物化感物質中，酚酸類是其中的一類重要物質，許多植物體內均有酚酸類物質存在，如穗花狐尾藻體內分離出了12種酚酸類物質（Planas，1981）、苦草中分離了9種酚酸類物質（高云霓等，2011），大麥桿在水體中產生多種不飽和脂肪酸、酚酸類和蒽醌類物質（Schrader，2003）。酚酸類物質可以增加細胞膜通透性，導致細胞內溶物外流和誘導脂質過氧化，最終抑制植物生長或導致組織壞死（Li，2010）。阿魏酸化學名稱為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，阿魏酸乙酯化學名稱為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸乙酯，均是肉桂酸（3-苯基丙烯酸）的衍生物，屬于酚酸類物質。高云霓（2010）69從伊樂藻（Elodea nuttallii）分離的阿魏酸對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）有化感作用，其半抑制濃度EC50（72 h）為 128.8 mg?L-1；張庭廷等（2007）發現酚酸類物質阿魏酸對水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）及蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）均有明顯的抑制作用，其EC50（120 h）分別為162.4 mg?L-1和177.7 mg?L-1，推測酚酸類物質化感抑制作用的機理可能與自由基的產生以及膜脂質過氧化增加引起藻細胞膜結構的破壞、細胞功能受損有關。本研究選取兩種典型的酚酸類物質（阿魏酸和阿魏酸乙酯），其中阿魏酸對藻類的化感作用常見于文獻報道，但其衍生物阿魏酸乙酯對藻類的化感作用缺少關注。

溶解性有機質（Dissolved organic matter，DOM）在水環境中普遍存在，在污染物的緩解、轉化和地球有機化學循環中起著重要作用。水體中的溶解性有機質主要為腐植質，可占水體生態體系中總有機質的50%～80%（黃昌勇，2000；Ghabbour et al.，2003）。腐植質是大分子混合物，組成復雜，不具有特定的結構，分子量由幾千至幾十萬道爾頓，其中在任何pH值均可溶解的部分為富里酸（或稱為黃腐酸，Fulvic acid），當pH小于2時從溶液中分離出來的部分為腐植酸（或稱為胡敏酸，Humic acid），既不溶于堿又不溶于酸的部分為腐黑物（或稱為腐殖素，Humin）（Dosko?il et al.，2018；Klu?áková，2016；周霞萍，2015）。很多植物在水體中腐爛也可以釋放出腐植物質，但腐植物質對化感作用的環境行為的影響還未被充分探討。因此，本實驗在研究阿魏酸和阿魏酸乙酯對藻類的化感作用基礎上，探討以富里酸為代表的溶解性有機質對化感作用的影響，以及產毒銅綠微囊藻在響應化感作用過程中超氧化物歧化酶、丙二醛及微囊藻毒素變化。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗藥品、材料和儀器

阿魏酸和阿魏酸乙酯均購自國藥集團（沃凱，質量分數≥97%）；富里酸購自上海麥克林生化科技有限公司（麥克林，質量分數≥85%）。微囊藻藻毒素（microcystin-LR，MC-LR）標準品由中國科學院水生生物研究所典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB）提供，質量濃度 1.0 μg?mL-1。

銅綠微囊藻 FACHB-905（Microcystis aeruginosa）由中國科學院水生生物研究所典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB）提供，該藻為單細胞，分離于滇池。在培養箱中，光強 25 μE?m-2?s-1，溫度(25±1) ℃，光周期 12 h∶12 h 條件下在BG11培養基中進行培養。

高效液相色譜儀（Waters 600，USA），紫外可見分光光度計（UV-3010型，日本Hitachi公司）。

1.2 阿魏酸和阿魏酸乙酯對銅綠微囊藻的化感作用

化感物質一般需用少量的有機溶劑助溶后再進行化感實驗。已有實驗證明，低于體積分數為0.3%的二甲基亞砜（DMSO）（高云霓，2011）或者體積分數為0.1%甲醇（阮鈴鈴，2011）15對銅綠微囊藻的生長無影響。本實驗中，將阿魏酸和阿魏酸乙酯溶解在 0.1%（體積分數）二甲基亞砜（DMSO）中，同時對照實驗中加入相同體積DMSO。將處于生長對數期的銅綠微囊藻500 mL置于錐形瓶中（控制 OD680保持一致），分別加入 20、40、60、80、100和200 mg?L-1阿魏酸和阿魏酸乙酯，以不添加阿魏酸和阿魏酸乙酯為對照組。在7 d內每天取10 mL藻液測量其葉綠素a質量濃度。化感實驗藻類生長條件與1.1相同。

1.3 富里酸對化感作用的影響

腐植酸在天然水體中的質量濃度一般為 1～20 mg?L-1（Kim et al.，2014），因此選擇 1 mg?L-1和 10 mg?L-1富里酸進行實驗。將處于生長對數期的銅綠微囊藻置于500 mL錐形瓶中（控制OD680保持一致），分為 2 組，分別加入 1 mg?L-1和 10 mg?L-1富里酸。在每組添加富里酸的藻液中，分別加入40、80和100 mg?L-1阿魏酸，以不添加阿魏酸為對照組。每隔1天取10 mL藻液測量其葉綠素a質量濃度。化感實驗藻類生長條件與1.1相同。

1.4 指標測定

每隔1天取經40、80和100 mg?L-1阿魏酸和阿魏酸乙酯化感處理后的銅綠微囊藻樣品10 mL，離心（7000 r?min-1，3 min）濃縮，將藻泥懸浮于 3 mL 50 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（PBS pH=7.8），然后使用超聲細胞粉碎機冰浴條件下超聲破碎（400 W，3 min），離心（8000 r?min-1，15 min，4 ℃）后取上清液用于蛋白質和酶活測定。超氧化物歧化酶（Superoxide dismufase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及總蛋白（考馬斯亮蘭-G250）的測定均使用試劑盒（南京建成）來完成。葉綠素a的測定方法參考文獻（陳宇煒等，2000），微囊藻毒素MC-LR的測定方法參考文獻（彭亮等，2011）。

1.5 數據處理

參照文獻《水和廢水監測分析方法》（國家環境保護總局，2002）720，根據葉綠素a計算阿魏酸和阿魏酸乙酯對藻類的生長抑制率（Inhibition Ratio，IR）：

IR=(1-N/N0)×100% （1）

式中，N為實驗組的藻類葉綠素a含量；N0為對照組藻類葉綠素a含量。對阿魏酸和阿魏酸乙酯濃度與 96 h藻類生長抑制百分率作一元線性回歸分析，計算50%抑藻的效應濃度 EC50（mg?L-1）（國家環境保護總局，2002）721。各實驗組均設3個重復，運用SPSS 13.0進行顯著性檢驗（ANOVA），P＜0.05時，具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 阿魏酸和阿魏酸乙酯對銅綠微囊藻生長的影響

將不同質量濃度的阿魏酸和阿魏酸乙酯加入到生物量相同的銅綠微囊藻培養液中，其7 d生長情況分別見圖1和圖2。未投加阿魏酸和阿魏酸乙酯的銅綠微囊藻生長良好。由圖1可知，投加20、40和60 mg?L-1阿魏酸的銅綠微囊藻第7天葉綠素a分別比對照組增加了 17.1%、20.6%和 39.7%。80 mg?L-1阿魏酸實驗組的銅綠微囊藻第 7天葉綠素 a與對照組無顯著性差別（P=0.682）。100 mg?L-1和200 mg?L-1阿魏酸實驗組從第1天開始銅綠微囊藻葉綠素 a逐漸降低，第 7 天 100 mg?L-1和 200 mg?L-1阿魏酸實驗組藻類生長抑制率 IR分別為 79.4%和83.5%。由圖2可知，投加20、40和60 mg?L-1阿魏酸乙酯的銅綠微囊藻葉綠素a在第7天與對照組相比略高，但無顯著性差別（P值分別為0.714、0.346和 0.558）。80、100和 200 mg?L-1阿魏酸乙酯實驗組的銅綠微囊藻的葉綠素a下降，而且質量濃度越高，其葉綠素a值越低，表現為藻類顏色由綠變黃甚至死亡。第7天80、100和200 mg?L-1阿魏酸乙酯實驗組藻類生長抑制率IR分別為80.6%、84.1%和85.5%。

n=3. The same below

圖2 不同質量濃度阿魏酸乙酯對銅綠微囊藻生長的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of ethyl ferulate on the growth of Microcystis aeruginosa

2.2 阿魏酸和阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻的MDA變化

圖3 阿魏酸實驗組銅綠微囊藻MDA變化Fig. 3 Effect of ferulic acid on MDA in Microcystis aeruginosa

圖4 阿魏酸乙酯實驗組銅綠微囊藻MDA變化Fig. 4 Effect of ethyl ferulate on MDA in Microcystis aeruginosa

圖3和圖4所示為加入不同質量濃度阿魏酸和阿魏酸乙酯后，7 d內銅綠微囊藻溶液中MDA的變化過程。40 mg?L-1阿魏酸實驗組銅綠微囊藻MDA高于對照組（P=0.000），第7天比對照組升高31.0%；100 mg?L-1阿魏酸實驗組銅綠微囊藻MDA前3天逐漸升高，比對照組升高83.5%，第5天開始下降，第7天銅綠微囊藻MDA比對照組下降48.3%。由圖4可知，阿魏酸乙酯實驗組與阿魏酸實驗組變化趨勢相同，但是80 mg?L-1阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻的MDA含量顯著降低（P=0.000）。

2.3 阿魏酸和阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻 SOD變化

如圖 5 和圖 6 所示，40 mg?L-1阿魏酸、40 mg?L-1阿魏酸乙酯處理后，銅綠微囊藻的 SOD活性出現了明顯的上升（P 值分別為 0.010、0.002），40 mg?L-1阿魏酸和阿魏酸乙酯處理后第7天SOD與對照組（7.48 U?mg-1）相比，分別增加到 11.02 U?mg-1和12.28 U?mg-1。但是經高質量濃度的阿魏酸（100 mg?L-1）和阿魏酸乙酯（80 mg?L-1和 100 mg?L-1）處理后，SOD活性呈現下降趨勢，100 mg?L-1阿魏酸、80 mg?L-1和100 mg?L-1阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻第7天SOD與第1天相比分別減少到1.88、1.37 和 1.24 U?mg-1。

2.4 阿魏酸和阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻毒素釋放變化

表1所示為不同質量濃度阿魏酸和阿魏酸乙酯作用后銅綠微囊藻胞外毒素MC-LR變化情況。結果表明，對照組和用低質量濃度阿魏酸（40 mg?L-1）和阿魏酸乙酯（40 mg?L-1）處理的銅綠微囊藻中未檢測到溶解性藻毒素 MC-LR；80 mg?L-1阿魏酸處理后的銅綠微囊藻在前3天未檢測到MC-LR，5～7 d時均檢測到MC-LR，但是MC-LR的質量濃度較低（0.08～0.09 μg?L-1）。100 mg?L-1阿魏酸、80 mg?L-1和100 mg?L-1阿魏酸乙酯處理后第1～7天溶液中均檢測到 MC-LR，第 1～3天質量濃度增加，最高質量濃度是第3天（100 mg?L-1阿魏酸和100 mg?L-1阿魏酸乙酯實驗組）和第5天（80 mg?L-1阿魏酸乙酯實驗組），之后MC-LR濃度下降。

圖6 阿魏酸乙酯處理后銅綠微囊藻SOD變化Fig. 6 Effect of ethyl ferulate on SOD in Microcystis aeruginosa

未檢測到 Not detected

2.5 富里酸對化感作用的影響

圖 7和圖 8所示分別為 1 mg?L-1和 10 mg?L-1富里酸（Fulvic acid，FuA）對化感作用的影響。阿魏酸濃度均為 0 mg?L-1的實驗組中，1 mg?L-1富里酸加入后7 d內銅綠微囊藻葉綠素a均上升，第7天其葉綠素a是對照組的2.54倍；添加10 mg?L-1富里酸后7 d內銅綠微囊藻葉綠素a下降，第7天其葉綠素a是對照組的57.1%。從圖7和圖8還可以看出，1 mg?L-1富里酸加入后，40 mg?L-1和 80 mg?L-1阿魏酸實驗組均表現為促進其生長，100 mg?L-1阿魏酸實驗組藻液葉綠素a降低（P=0.001）。加入 10 mg?L-1富里酸后，40、80 和 100 mg?L-1阿魏酸實驗組葉綠素 a均下降（P值分別為 0.001、0.000 和 0.000）。

圖7 1 mg?L-1富里酸（FuA）與不同質量濃度阿魏酸（FeA）對銅綠微囊藻囊藻生長的影響Fig. 7 Effect of fulvic acid (1 mg?L-1, FuA) with different concentrations of ferulic acid (FeA) on the growth of Microcystis aeruginosa

圖8 10 mg?L-1富里酸（FuA）與不同質量濃度阿魏酸（FeA）對銅綠微生長的影響Fig. 8 Effect of fulvic acid (10 mg?L-1, FuA) with different concentrations of ferulic acid (FeA) on the growth of Microcystis aeruginosa

3 討論

關于阿魏酸對藻類的化感作用已經有相關報道（郭亞麗等，2013；Wang et al.，2016）。本實驗通過葉綠素a值隨時間變化指示微囊藻生長情況，20、40、60和80 mg?L-1阿魏酸能夠促進銅綠微囊藻生長，而高質量濃度的阿魏酸（100 mg?L-1和200 mg?L-1）和阿魏酸乙酯（80、100 和 200 mg?L-1）則抑制其生長。結果與文獻報道相一致（郭亞麗，2013，Techer et al.，2016），原因可歸為低質量濃度的化感物質改變了藻細胞的通透性，促使培養基中的營養鹽被快速吸收利用（Gross，2003），當化感物質質量濃度進一步增加，藻細胞出現損傷和破裂，伴隨著細胞內物質流失和細胞凋亡。李鋒民（2005）通過從蘆葦中分離得到的具抑藻活性的組分，證實其能夠造成細胞膜的破裂，使細胞內K+、Ca2+和Mg2+流失，從而造成藻細胞的死亡。

通過計算，阿魏酸對銅綠微囊藻的EC50（96 h）為123.7 mg?L-1，阿魏酸乙酯EC50（96 h）為87.7 mg?L-1，阿魏酸乙酯抑制藻類生長能力強于阿魏酸。對于相同初始生物量的銅綠微囊藻，80 mg?L-1阿魏酸乙酯實驗組葉綠素 a低于相同濃度阿魏酸實驗組，相當于100 mg?L-1阿魏酸對銅綠微囊藻的化感作用。其原因是阿魏酸分子親水性強，難以透過藻細胞生物膜脂質雙分子層，阿魏酸乙酯的親酯性比阿魏酸強，較低質量濃度就能夠改變藻細胞的通透性，導致其化感作用增強。阮鈴鈴（2011）19利用系統聚類分析方法比較了19種多酚物質抑藻效能，認為阿魏酸具有中等強度的化感效能。在沉水植物伊樂藻（Elodea nuttallii）體內檢測到的主要酚酸物質為阿魏酸和咖啡酸，干物含量在500 μg?g-1左右（高云霓，2010）64，因此研究阿魏酸和阿魏酸乙酯的對藻類的化感作用有一定的應用價值。

MDA被廣泛用于衡量膜脂過氧化損傷，MDA的積累可在一定程度上反映體內自由基活動狀態，隨著·OH和·O2-等自由基（ROS）增加，細胞自動啟動膜脂過氧化作用，導致膜的損傷和破壞，從而積累MDA（Ayala et al.，2014）。另一方面，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它可以清除活性氧，保護細胞免受傷害。本實驗結果顯示，低質量濃度阿魏酸和阿魏酸乙酯（40 mg?L-1）作用下的銅綠微囊藻SOD活性顯著上升（P＜0.05），清除了部分氧自由基。高質量濃度（100 mg·L-1）阿魏酸和阿魏酸乙酯（80 mg?L-1和100 mg?L-1）實驗組中銅綠微囊藻生長抑制率IR均超過了80.0%，部分藻細胞發生了死亡、裂解，表明銅綠微囊藻細胞防御系統被破壞，且不可逆轉，因此導致銅綠微囊藻5 d后MDA含量下降，其結果與文獻一致（王立新等，2004；馮彬等，2018）。

銅綠微囊藻作為主要的產微囊藻毒素（MCs）藻株，藻細胞正常生長過程中，MCs主要貯存在藻細胞內，當藻細胞死亡后，胞內毒素就會釋放到胞外形成溶解態毒素（Murraygulde et al.，2002）。本實驗中，低質量濃度阿魏酸（40 mg?L-1）和阿魏酸乙酯（40 mg?L-1）實驗組均能夠促進微囊藻生長，藻細胞未破裂，所以溶液中并未檢測到MCs存在；但是，在80 mg?L-1阿魏酸實驗組后期（5～7 d），以及 100 mg?L-1阿魏酸、80 mg?L-1、100 mg?L-1阿魏酸乙酯處理整個過程（1～7 d）中，溶液均檢測到MC-LR；說明此質量濃度下的阿魏酸和阿魏酸乙酯可造成銅綠微囊藻藻細胞破裂，該實驗結果也與實驗過程中藻類生物量變化及細胞體內MDA變化趨勢相一致。值得注意的是，溶液中檢測到的MC-LR含量均未超過中國《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002）中規定小于1.0μg?L-1的標準限值。

目前，有相關研究關注了溶解性有機質包括腐植酸或者富里酸對藻類生長的直接影響（Rengefors et al.，2008；Lee et al.，2009；王靜等，1992）。低質量濃度（2 mg?L-1）的富里酸可以使扁形膝口藻（Gonyostomum semen）密度和生長速率增加，但是增大富里酸質量濃度（9 mg?L-1和 22 mg?L-1）不能提高其生長速率（Rengefors et al.，2008）。對韓國的5個湖泊的調查發現，0.1～3 mg?L-1腐植酸能夠緩慢增加近頭狀偽蹄形藻（Pseudokirchneriella subcapitata）藻細胞數量，3～10 mg?L-1腐植酸能夠顯著提高生長速率，但是超過了10 mg?L-1會抑制其生長（Lee et al.，2009）。本實驗結果表明，1 mg·L-1富里酸能夠促進銅綠微囊藻生長（見圖 7中空白組），10 mg?L-1富里酸能夠抑制銅綠微囊藻生長（見圖8中空白組），結論與文獻一致（Rengefors et al.，2008；Lee et al.，2009）。低質量濃度的富里酸對藻類生長有促進作用，其原因是其為藻類提供了溶解性有機碳（Rengefors et al.，2008；Arvola et al.，1998），溶解性有機碳可以使衣藻（Chlamydomonas）的生物量增加23%（Tittel et al.，2004）。高質量濃度（10 mg?L-1）的腐植酸對藻類的抑制作用，是影響了銅綠微囊藻對鐵離子的生物可利用性所導致（Imai et al.，1999；Sun et al.，2005），Fe3+與 DOM分子基團上–COOH和–OH結合導致DOM的生物可利用性降低（Lee et al.，2009），目前，關于溶解性有機質與化感物質的作用較少受到關注。在本實驗中，富里酸加入到阿魏酸對藻類的化感作用體系后，阿魏酸對銅綠微囊藻的抑制作用大于單獨使用該劑量的阿魏酸對藻類的化感作用，但是此過程中富里酸的具體作用機制尚未明晰。

4 結論

（1）100 mg?L-1和 200 mg?L-1阿魏酸和 80、100和 200 mg?L-1阿魏酸乙酯對銅綠微囊藻具有化感作用。阿魏酸對銅綠微囊藻的EC50（96 h）為123.7 mg?L-1，阿魏酸乙酯 EC50（96 h）為 87.7 mg?L-1，阿魏酸乙酯抑制能力強于阿魏酸。

（2）40 mg?L-1阿魏酸和阿魏酸乙酯作用下，銅綠微囊藻受到脅迫，MDA含量增加促進SOD活性上升。100 mg?L-1阿魏酸和 80 mg?L-1阿魏酸乙酯加劇了細胞膜脂過氧化，使藻類自由基大量累積，超過抗氧化酶系統清除能力，導致藻細胞結構破壞，細胞死亡、裂解。

（3）低質量濃度的阿魏酸（40 mg?L-1）和阿魏酸乙酯（40 mg?L-1）實驗組均未檢測到MC-LR，100 mg?L-1阿魏酸、80 mg?L-1和 100 mg?L-1阿魏酸乙酯處理后第 1～7天溶液中均檢測到 MC-LR，但其含量均未超過中國《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002）中規定小于 1.0 μg?L-1的標準限制。

（4）單獨使用低質量濃度富里酸（1 mg?L-1）能夠促進銅綠微囊藻生長，高質量濃度富里酸（10 mg·L-1）能夠抑制其生長。富里酸加入到阿魏酸對藻類化感作用體系后，阿魏酸對銅綠微囊藻的抑制作用大于單獨使用該劑量的阿魏酸對藻類的化感作用。

致謝：吳忠興教授和李杰副教授對論文寫作和修改給出專業的意見，Dr. JIA M.對英文摘要修改提供幫助，謹此致謝。