太湖梅梁灣沉積物中鐵氧化氨作用及其脫氮貢獻

劉新，王芳, ，江和龍，姚宗豹*

1. 南京林業大學生物與環境學院，江蘇 南京 210037；

2. 中國科學院南京地理與湖泊研究所/湖泊與環境國家重點實驗室，江蘇 南京 210008

氮、磷營養元素的過度輸入會提高受納水體的營養水平，從而導致水體富營養化，富營養化是目前水生生態系統面臨的重要環境問題之一。富營養化的負面影響包括藍藻水華（Heisler et al.，2008）、破壞食物網（Capriulo et al.，2002）和導致水體缺氧（Diaz et al.，2008）。氮（N）是引起水生生態系統富營養化的主要元素之一，減少外部氮輸入和控制內部氮負荷對降低水生態系統富營養化水平至關重要（Conley et al.，2009；薄濤等，2017）。

沉積物是富營養化湖泊氮的重要來源之一，當氮的外源輸入得到控制后，沉積物內源氮負荷對水環境的影響將逐漸顯現。只有同時控制外源氮輸入和削減內源氮釋放才能逐漸改善富營養化湖泊的營養水平（Burger et al.，2007）。沉積物中涉氮微生物過程是無機氮遷移轉化的重要途徑，如反硝化和厭氧氨氧化（Anammox），可以將無機氮轉化為氮氣釋放到大氣中，從而實現沉積物氮的去除，改善水環境的營養水平（Trimmer et al.，2009；陳重軍等，2014）。最近研究發現，除了反硝化和厭氧氨氧化過程，厭氧鐵氧化氨過程（Feammox）也可以在厭氧條件下將氨氧化為N2，實現氮的去除。該過程是耦合三價鐵還原和氨厭氧氧化，在Fe(Ⅲ)被還原為Fe(Ⅱ)的同時，N被氧化為N2（Ding et al.，2014；Yang et al.，2012）、N（Clément et al.，2005；Huang et al.，2015；Sawayama，2006）或N（Yang et al.，2012；Li et al.，2018；Weng et al.，2017）。Feammox是一種微生物過程，鐵還原速率與鐵還原菌（FeRB）豐度有顯著的相關性（Ding et al.，2017；Li et al.，2015），Huang et al.（2015）報道稱，Acidimicrobiaceae A6能夠催化Feammox過程，將N氧化為。

研究人員已經在多種環境中發現 Feammox過程，如水稻田土壤（Ding et al.，2014；Zhou et al.，2016）、河岸帶沉積物（Clément et al.，2005；Ding et al.，2017；Park et al.，2009；丁幫璟等，2018）、林地土壤（Huang et al.，2015；Yang et al.，2012）、河流沉積物（Huang et al.，2016）以及活性污泥系統（Sawayama，2006；Su et al.，2017；Yang et al.，2018；王亞娥等，2014；吳胤等，2017）。Ding et al.（2014）調查了水稻田土壤的Feammox過程，結果表明水稻田土壤中 Feammox速率為 7.8～61 kg?hm-2?a-1，約占氮肥施用量的 3.9%～31%。Ding et al.（2017）發現河岸帶沉積物中 Feammox速率為0.20～0.37 mg?kg-1?d-1，占氮肥施用量的 4%～7.3%。Li et al.（2015）等通過15同位素示蹤結合乙炔抑制實驗調查了長江流域濕地的 Feammox過程，研究發現 Feammox能夠將氧化為 N2、或 NAnammox和反硝化過程能夠將產生的N和轉化為N2，實現氮的去除。

1 材料和方法

1.1 采樣點分布及樣品采集

太湖是一個富營養化的大型淺水湖泊，梅梁灣位于太湖北部，受北部梁溪河、閭江等河道輸入和無錫市的影響，梅梁灣屬于藻型湖區，2017年5月梅梁灣所在區域為中度富營養狀態，由于入湖污染主要來自梅梁灣北部，并向南逐漸稀釋擴散，水體及沉積物氮磷存在自然梯度，灣內濃度高于灣外敞開湖區。因此，在梅梁灣內由北向南設置1#、3#、4#點、5#樣點進行研究（圖1），考察梅梁灣沉積物中鐵氧化氨過程特征。

2017年 5月在各樣點采集樣品，采樣日氣溫27 ℃，水溫24 ℃。采集的沉積物樣品放置在冷藏采樣箱內盡快運送至實驗室。在厭氧手套箱中，將每個位點的樣品分為3份，第1份保存在4 ℃條件下，用于測定沉積物的理化性質[pH、含水率、TOC、、、、Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)]；第 2 份用于同位素示蹤和乙炔抑制實驗，測定Feammox速率；第3份保存在-80 ℃條件下，用于分析沉積物微生物特征。

1.2 同位素示蹤實驗

圖1 太湖梅梁灣采樣點分布圖Fig. 1 Map of Meiliang Bay, Lake Taihu showing the locations of sampling sites

同位素示蹤實驗接種在厭氧手套箱中完成，在充有 φ=99.99%氦氣（He）的厭氧手套箱中，將沉積物樣品與厭氧去離子水按照1∶3（m∶V）的比例混合均勻，并在黑暗條件下預處理36 h，以去除沉積物本底氧氣和。取10 g經預處理后的均質泥水混合物置于100 mL血清瓶中，然后進行同位素接種。同位素接種實驗分3組：（1）加入厭氧去離子水作為對照組；（2）加入 100 μmol?L-1Cl；（3）加入 100 μmol?L-115NH4Cl+C2H2。血清瓶用橡膠塞和鋁蓋密封。24 h后立即收集15 mL氣體樣品，通過同位素質譜儀（IRMS，Thermo Finnigan Delta V Advantage，Bremen，Germany）測定、。氣體樣品收集后，立即對血清瓶內的漿液進行二次取樣，測定 Fe(Ⅱ)和 Fe(Ⅲ)濃度變化并核算 Fe(Ⅲ)還原速率（Lovley et al.，1987）。以Cl處理組中的產生速率來表征Feammox速率（Li et al.，2015）。

1.3 沉積物理化性質分析

將沉積物和去離子水以1∶2.5混合后，用pH計測量泥水混合物的 pH值來代表沉積物的 pH。以10 g沉積物在60 ℃下烘至恒重前后的質量差來核算沉積物含水率。沉積物總有機碳（TOC）用元素分析儀測定，測定前沉積物中的碳酸鹽用1 mol?L-1鹽酸去除。沉積物中的活性總鐵（TFe）和活性Fe(Ⅱ)的提取及測定參考Lovley et al.（1987）的文獻，可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量以活性總鐵和 Fe(Ⅱ)含量的差值來計算。

1.4 DNA提取和PCR擴增

沉積物樣品（0.25 g）總DNA采用Power Soil DNA試劑盒（MO BIO Laboratories，美國）提取。DNA純度和濃度采用 Nanodrop-2000分光光度計（Thermo，美國）測定。Li et al.（2015）報道稱潮間帶濕地 Feammox過程與鐵還原菌希瓦氏菌（Shewanella spp.）和地桿菌（Geobacteraceae spp.）豐度之間有顯著的相關性；Huang et al.（2015）通過短期培養發現微酸菌（Acidimicrobiaceae）科的Acidimicrobiaceae A6可能直接參與將氧化為的 Feammox過程。因此，本研究調查富營養化湖泊沉積物中希瓦氏菌（Shewanella spp.）、地桿菌（Geobacteraceae spp.）、Acidimicrobiaceae科及Acidimicrobiaceae A6豐度。Shewanella spp.使用的引物為 She 120f（5′-GCC TAGGGA TCT GCC CAG TCG-3′）和 She 220r（5′-CTA GGTTCA TCC AAT CGC G-3′）；Geobacteraceae spp.使用的引物為Geo564f（5′-AAGCGT TGT TCG GAW TTA T-3′）和 Geo840r（5′-GGCACT GCA GG GGT CAA T A-3′）；Acidimicrobiaceae使用的引物為 362f（CGG TCC AGA CTC CTA CGG GA）和 539r（GAC AGG GTT TTA CAG TCC GAA GA）；Acidimicrobiaceae A6使用的引物為342f（GCA ATG GGG GAA ACC CTG AC）和439r（ACC GTC AAT TTC GTC CCT GC）。qPCR擴增及相應溫度程序參考Somenahally et al.（2011）和 Huang et al.（2016）的文獻，定量結果為3次測試的平均值。

1.5 統計分析

運用SPSS 22.0進行數據處理和分析，采用單因素方差分析（ANOVA）對比不同處理之間的差異性，采用Pearson相關分析評價Feammox、沉積物性質、鐵還原菌之間的相關性；不同處理組數據之間的顯著性差異水平設置為0.05。運用Origin 9.2軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 沉積物理化性質

太湖梅梁灣沉積物理化性質測定結果詳見表1。pH值范圍為7.22～7.62；含水量在52.6%～57.3%之間；可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量在 5.32～6.95 g?kg-1之間；活性 Fe(Ⅱ)含量為 0.74～0.87 g?kg-1；NH4+-N在 0.11～0.16 g?kg-1之間；NOx--N 在 0.03～0.07 g?kg-1之間；TOC在1.18%～2.38%之間。TH04點位的可微生物還原 Fe(Ⅲ)和 TOC含量高于其他采樣點。TH05采樣點的活性Fe(Ⅱ)、TOC低于其他采樣點。TH01采樣點的 NH4+高于 TH03、TH04、TH05采樣點。

2.2 同位素實驗中30N2和29N2產生特征

表1 太湖梅梁灣采樣點沉積物理化特征Table 1 Chemical characteristics of sedimnts of Meiliang bay, Lake Taihu

圖2 對照實驗、15NH4+和15NH4++C2H2實驗組30N2（a）和29N2（b）產生速率Fig. 2 Mean 30N2 (a) and 29N2 (b) production rates in the control, 15NH4+ and 15NH4+ + C2H2 treatments for the sediments n=3. The same below

2.3 同位素示蹤實驗Fe(Ⅲ)還原速率

同位素示蹤實驗結束后，通過測定沉積物中Fe(Ⅲ)含量變化，核算了 Fe(Ⅲ)還原速率，結果如圖3所示。只添加的實驗組Fe(Ⅲ)還原速率為 0.23～0.31 g?kg，高于+C2H2實驗組（0.7～0.27 g?kg），兩者均高于相應采樣點對照組的 Fe(Ⅲ)還原速率（0.15～0.19 g?kg-1?d-1）。與實驗結果類似，在 4個采樣點中，TH04的 Fe(Ⅲ)還原速率最大，TH05的Fe(Ⅲ)還原速率最小。

圖3 對照實驗、和C2H2實驗組Fe(Ⅲ)還原速率Fig. 3 Fe(Ⅲ) reduction rates measured through isotope tracer incubations(control, and+C2H2 experiments)

2.4 富營養化湖泊沉積物中的FeRB豐度

梅梁灣沉積物中希瓦氏菌（Shewanella spp.）、地桿菌（Geobacteraceaespp.）、微酸菌（Acidimicrobiaceae）科及AcidimicrobiaceaeA6的豐度如圖4所示。希瓦氏菌（Shewanella spp.）的基因豐度最高，為 2.98×108～4.02×108copies?g-1（干質量，下同）。地桿菌（Geobacteraceaespp.）、微酸菌（Acidimicrobiaceae）科及 Acidimicrobiaceae A6的豐度依次為 2.07×108～2.6×108、0.5×108～0.68×108和 0.22×108～0.33×108copies?g-1。在 4 個采樣點的沉積物中，TH04采樣點的4種微生物的基因拷貝數都大于其他采樣點的基因拷貝數。

3 討論

3.1 富營養化湖泊沉積物中Feammox的發生

雖然水稻田土壤、河岸帶沉積物、林地土壤、河流沉積物等生態系統中均存在 Feammox過程，但是關于富營養化湖泊沉積物中 Feammox過程特征及其對氮循環的貢獻卻鮮有報道，因此，本研究通過同位素示蹤結合乙炔抑制研究了富營養化湖泊沉積物中Feammox過程及其作用。由于在同位素示蹤前，沉積物本底氧氣、和已經被消耗殆盡，因此同位素示蹤實驗中的產生只可能來自于Feammox過程中的直接氧化，或者是 Feammox氧化為然后經 Anammox、反硝化過程產生 N2。和C2H2實驗組的 Fe(Ⅲ)還原率明顯高于對照組，表明添加和+C2H2能夠提升Fe(Ⅲ)還原，以上結果都表明富營養化湖泊沉積物中存在鐵氧化氨作用。此外，只添加實驗組的 Fe(Ⅲ)的還原率與（r=0.815，P＜0.01）和的產生速率（r=0.799，P＜0.01）呈顯著相關性（圖5），進一步表明富營養化的湖泊沉積物中發生了Feammox過程。只添加實驗組的產生速率大于實驗組的產生速率，表明Feammox氧化的產物不僅僅是N2，還包括和，Feammox或通過耦合Anammox和反硝化過程會導致富營養化湖泊沉積物的氮損失。

沉積物Feammox過程受到多個因素的影響，如可微生物還原Fe(Ⅲ)含量、pH、TOC、微生物群落結構特征等（Li et al.，2015）。Feammox速率與沉積物可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量之間呈明顯正相關（r=0.648，P＜0.05），表明沉積物可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量高的區域更可能發生Feammox反應，Feammox速率或更高，該結果與已有的報道一致（Ding et al.，2017；Li et al.，2015）。同樣地，Feammox 速率與沉積物 TOC 呈顯著相關性（r=0.906，P＜0.01），Ding et al.（2014）和 Ding et al.（2017）也報道稱高 TOC含量有助于Feammox的發生，這可能是由于高TOC會促進黏土礦物釋放鐵氧化物，從而促進Feammox反應的發生（Melton et al.，2014）。盡管pH值是調節Fe氧化物和鐵氧化還原反應的重要因子，但pH值與Feammox速率之間不存在顯著相關性（r=227，P＞0.05），表明 pH 值對富營養化湖泊沉積物中的Feammox反應影響不大。

3.2 Fe(Ⅲ)還原速率、Feammox速率、FeRB之間相關性

異化鐵還原作用會利用有機質作為電子供體實現 Fe(Ⅲ)還原（Melton et al.，2014），微生物的新陳代謝和細胞生長也會利用環境中的 Fe(Ⅲ)（Raiswell et al.，2012），因此 Fe(Ⅲ)的還原速率受多種因素或過程的影響。在添加的實驗中，外加提升了沉積物Fe(Ⅲ)的還原速率，同時Fe(Ⅲ)還原速率與（Feammox速率）產生速率之間存在顯著相關性（圖5），這表明Fe(Ⅲ)還原速率的提升可能主要是由于沉積物中發生了因外加導致的Feammox過程。的產生可能來自于 Feammox氧化沉積物本底14NH4+為，然后厭氧氨氧化菌（AnAOB）利用產生的與生成；亦或是Feammox氧化沉積物本底為，經反硝化被還原，AnAOB利用產生的與生成。因此的產生也與Feammox過程有關，而且本研究中Feammox與只添加實驗組的產生速率之間呈顯著相關性（圖5）。

圖5 只添加實驗組中Fe (Ⅲ)還原率與2和產生速率的相關性Fig. 5 Pearson’s correlations of iron reduction rates with both (a) and (b) production rates in the treatment

FeRB能夠以多種物質（如乙酸鹽、乳酸鹽、H2和氨）為電子供體還原 Fe(Ⅲ)（Melton et al.，2014）。Li et al.（2015）發現 Fe(Ⅲ)還原速率和Feammox速率與Geobacteraceaespp.和Shewanellaspp.呈顯著相關性。同樣地，本研究也發現Feammox速率與 Geobacteraceae spp.（r=0.735，P＜0.01）和Shewanella spp.（r=0.628，P＜0.05）呈顯著相關，這表明Geobacteraceaespp.和Shewanellaspp.在富營養化湖泊沉積物的 Feammox過程中可能起到重要作用。除了Geobacteraceae spp.和Shewanella spp.在Feammox過程中起到重要作用之外，Huang et al.（2015）通過培養實驗發現 Acidimicrobiaceae科的Acidimicrobiaceae A6在Feammox氧化為的途徑中起到重要作用。本研究也發現 Feammox速率與 Acidimicrobiaceae（r=0.635，P＜0.05）和Acidimicrobiaceae A6（r=0.644，P＜0.05）有顯著的相關性。因此，Feammox與FeRB的相關性分析表明，Feammox的發生為生物過程，可能是由FeRB催化發生，但是具體是哪一種鐵還原菌實現的，還需要開展進一步研究。

3.3 Feammox在氮循環中的作用

Feammox通過直接氧化 NH4+為 N2，或氧化為、，再耦合Anammox或反硝化將、轉化為N2，實現沉積物中的去除，從而導致氮損失。根據梅梁灣沉積物的濕體積密度（1.3 g?cm-3）和同位素接種實驗測得的Feammox速率，估算得到因 Feammox導致的氮損失量約為1.1～2.0 t?km-2?a-1，約占太湖人為氮輸入量（約 21.8 t?km-2?a-1，Gao et al.，2015）的 6.1%～9.4%。研究結果表明，Feammox過程是富營養化湖泊沉積物重要的氮匯，在沉積物無機氮的去除中起著重要的作用。

4 結論

研究表明，富營養化湖泊沉積物（太湖梅梁灣）中存在Feammox過程，Feammox通過直接氧化為 N2，或氧化為、再耦合 Anammox或反硝化將、轉化為N2，從而實現沉積物中的去除。同位素示蹤實驗測得太湖梅梁灣沉積物中 Feammox 速率為 0.28～0.43 mg?kg-1?d-1，因Feammox導致的氮損失約占太湖人為氮輸入量的6.1%～9.4%，Feammox過程是太湖梅梁灣沉積物重要的氮匯。FeRB參與了Feammox過程，對Feammox過程的發生起重要作用。