高效液相色譜法分析銀杏達莫的游離總氨基酸含量及其與維生素C的配伍觀察

李燕靈，林夏飛

0 引言

銀杏達莫注射液是由銀杏提取物和雙嘧達莫制成，臨床上用于治療冠心病、高血壓等疾病[1]，銀杏葉提取物的活性成分主要為銀杏黃酮和銀杏萜內酯[2]。雙嘧達莫是一種傳統的心血管系統藥物，其具有抗凝及擴張冠狀動脈的效果[3]。銀杏達莫注射液對于預防心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的改善效果[4]。有些研究對銀杏達莫注射液的成分進行研究，但是主要為雙嘧達莫和槲皮素等[5]，尚未有研究人員對銀杏達莫中的氨基酸含量進行分析，并且對于銀杏達莫與其他藥物配伍方面，也未見有銀杏達莫與維生素C配伍穩定性的相關報道。為了對銀杏達莫產品質量進行進一步控制，本研究對銀杏達莫中氨基酸含量進行分析，并觀察銀杏達莫與維生素C配伍的穩定性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 所需試劑 銀杏達莫注射液(A企業，批號：20161202；B企業，批號：161033；C企業，批號：160915)；甲醇、乙酸(美國Tedia公司)；17 種氨基酸混合溶液標準物質 GBW(E) 100062(購自中國計量科學研究院)；維生素C標準品(購自中國藥品生物制品檢定所，規格：100 mg/瓶，批號：162139C)，維生素C注射液[購自北京雙鶴藥業，批號：A201701182，規格：含維生素C(C6H8O6)2 g]；甲醇、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Veriti BP113D型分析電子天平(德國賽多利斯股份公司)；1300 A2型超聲清洗器(北京六一儀器廠)；D116C型高壓滅菌器(日本SANYO公司)；Mlilli-QM超純水純化儀(德國默克密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色譜柱及樣品的溫度為25 ℃，流速為0.5 ml/min，上樣量為3 μl；流動相：A相為0.15%(v/v)的乙酸水溶液，B相為含0.9%(v/v)的乙酸和30%(v/v)的甲醇水溶液。梯度程序：0～2.5 min，100%A；2.5～5 min，0～17% B；5～8 min，17%～33% B；8～8.5 min，33%～100% B；8.5～17 min，100%B。

1.2.2 檢測樣品溶液制備 使用0.22 μm濾膜將配伍比例為5∶1的銀杏達莫注射液、維生素C注射液過濾，取200 μL樣品溶液待測。

1.2.3 標準品溶液制備 取17種氨基酸混合溶液標準物質 200 μl，加水800 μl。得到混合標準儲液。依次取混合標準儲液 25、50、100、200、400 μl，分別加水至1 000 μl，得5個系列濃度的混合標準品溶液。

精密稱取維生素C標準品0.1 g，加流動相定容至100 ml，使標準品溶液濃度為1 mg/ml，用移液器吸取1 ml加入至容量管中，加入流動相至終濃度為20 μg/ml，作為最終標準品。

1.2.4 重復性及再現性 采用同樣方法，在第1次測定后1 d內測定200 μl樣品溶液，計算日內重復性的變異系數。采用同樣方法在第1次測定后3 d測定200 μl樣品溶液，計算日間重復性的變異系數。

1.2.5 繪制標準曲線 采用外標法考察氨基酸的標準曲線，以氨基酸峰面積作為縱坐標，以氨基酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到17種氨基酸的回歸方程。

1.2.6 檢出限 使用相應的軟件對結果進行計算，檢出限(LOD)=各目標物色譜峰的信噪比(S/N)。

1.2.7 配伍變化情況 在室溫(20±1) ℃及不避光的條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24 h觀察配伍溶液的外觀變化情況，測定配伍溶液的pH值，并檢測配伍溶液不溶性微粒數。

2 結果

2.1 標準工作曲線情況 以氨基酸峰面積為縱坐標，氨基酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到17種氨基酸的回歸方程。其中相關系數最高為Leu的0.999 7，最低為Met的0.995 7，檢出限最高為His的4.04 μmol/L，最低為Asp的1.16 μmol/L，見表1。

2.2 加標回收率情況 對3種銀杏達莫注射液檢測后各氨基酸的加標回收率進行統計，結果顯示，3種銀杏達莫注射液加標回收率最高的氨基酸均為Pro (107.0%、104.0%、105.2%)，最低分別為Gly (75.4%)、Glu (76.1%)、Phe (75.8%)，精密度最高為Ile (5.06%)，最低為Gly (1.43%)。見表2。

2.3 游離氨基酸含量 對3種銀杏達莫注射液中17種游離氨基酸的含量進行統計，結果顯示，3種銀杏達莫注射液中17種游離氨基酸的含量最高均為Leu (6.12、6.39、6.33 mg/g)，所有3種銀杏達莫注射液中17種游離氨基酸的平均總含量為61.26。見表3。

表1 銀杏達莫中17種游離氨基酸的線性回歸方程、相關系數及檢出限

表2 銀杏達莫中17種游離氨基酸的加標回收率及精密度(%)

2.4 銀杏達莫與維生素C配伍溶液外觀及pH值變化情況 對3種銀杏達莫注射液與維生素C配伍溶液不同時間的外觀及pH值變化情況進行統計，結果顯示，所有3種銀杏達莫注射液與維生素C配伍后的溶液24 h內外觀檢測和觀察均未出現沉淀、渾濁情況，并且無氣體產生，也無顏色變化，pH值呈現緩慢上升的趨勢。見表4。

2.5 銀杏達莫與維生素C配伍溶液不溶性微粒數 對3種銀杏達莫與維生素C配伍的溶液中不溶性微粒數進行統計，結果顯示，3種銀杏達莫與維生素C配伍的溶液中≥10 μm的不溶性微粒數隨時間增加而緩慢增加，而≥25 μm的不溶性微粒數隨時間增加基本無變化。見表5。

表3 銀杏達莫中17種游離氨基酸的含量

表4 配伍溶液不同時間外觀及pH值情況

表5 配伍溶液不同時間不溶性微粒數(粒/ml)

3 討論

王倬晅等[6]研究顯示，高效液相色譜可以有效、簡便、精確地測定銀杏達莫注射液水解前蘆丁、槲皮素的含量。任潔等[7]認為，高效液相色譜可用于銀杏達莫氯化鈉注射液的質量控制。王芮等[8]采用高效液相色譜對銀杏達莫注射液中雙嘧達莫含量進行測定，認為高效液相色譜可以用于銀杏達莫注射液的質量控制。李榮等[9]觀察銀杏達莫與三磷酸胞苷二鈉注射液配伍的穩定性，認為兩種藥物在配伍后6 h內外觀、pH值及峰形均無明顯變化，含量在4 h后明顯下降。兩種藥物在0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液中可配伍使用，但應在4 h內使用完。寧小艷等[10]認為，銀杏達莫注射液可以與0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液配伍使用。陳玲玲等[11]認為，銀杏達莫注射液與阿昔洛韋注射液存在配伍禁忌。范翠瓊等[12]認為，銀杏達莫與奧硝唑注射液混合后不穩定性風險增加，不建議混合使用。何正有等[13]認為，銀杏達莫注射液與吡拉西坦、維生素B6、硝酸甘油和多索茶堿可以配伍使用，而銀杏達莫注射液不宜與三磷酸胞苷二鈉、尼莫地平和奧扎格雷鈉配伍使用。張念森等[14]研究顯示，在室溫下，24 h維生素C和維生素K1的配伍液出現渾濁；而與肌苷注射液的配伍外觀無變化，但pH值及含量有變化，即溶液的穩定性發生變化。葉剛等[15]認為，丹參注射液與維生素C注射液配伍后的pH值和不溶性顆粒無明顯變化，溶液顏色有變化，有效成分含量變化較大。

本研究中未能檢測到銀杏達莫注射液與維生素C注射液配伍后的溶液中的小肽類成分，并且對檢測樣品中的同分異構體仍無法分辨，因此，應優化檢測方法，開發新的檢測方法，提高對衍生產物的檢測速度及選擇性，開發新的檢測試劑配伍，提高各種檢測試劑及衍生產物的穩定性，提高同分異構體和衍生物的檢出率和正確率。

通過本研究，我們可以明確分析銀杏達莫注射液中17種游離氨基酸的含量，并且通過高效液相色譜技術，分析銀杏達莫可以與維生素C配伍使用，所以我們認為，高效液相色譜技術可以用于銀杏達莫注射液的質量控制以及分析其與維生素C的配伍使用情況。