下調AFAP-1L2表達對人胰腺癌細胞吉西他濱化療敏感性的影響

劉 博，戚 誠*，趙 爽，趙曉東，劉學臣，張立超，石 暢

0 引言

胰腺癌惡性度高，早期發現困難，預后差，生存期短，化療敏感性差[1]。胰腺癌手術治療后治愈率也極低，轉移率高。對靶基因的篩選并尋找治療靶點，是胰腺癌治療的主要方向，也是可能延長生存期的治療手段[2]。吉西他濱(Gemcitabine，Gem)是一種細胞周期特異性的抗代謝化療藥，在DNA合成期(S期)殺滅腫瘤細胞，將癌細胞自G1期向S期的進展阻斷[3]。AFAP-1L2 (Actin filament-associated protein 1-like 2，XB130)是一種接頭蛋白，與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉移等惡性生物學行為相關[4]。本課題組前期研究發現，在胰腺癌細胞AFAP-1L2在mRNA、蛋白水平高表達，促進胰腺癌細胞增殖，抑制凋亡[5-6]。本研究采用siRNA (小干擾RNA)下調胰腺癌細胞株中AFAP-1L2表達，并給予吉西他濱化療干預，旨在觀察AFAP-1L2基因下調對胰腺癌細胞吉西他濱化療敏感性的影響，為胰腺癌治療靶點的選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞MiaPaCa-2購自中科院上海細胞庫，以1640培養基行貼壁細胞培養、傳代。AFAP-1L2山羊多克隆抗體(sc-138089)購自美國Santa Cruz公司。DAB顯色試劑盒購自美國SIGMA公司，BCA定量及ECL發光試劑盒均購自南京凱基生物公司。逆轉錄及擴增試劑盒、TRIzol(日本Takara公司)。LipofectamineTM2000、miRNA提取分離試劑盒、TRIzol、RPIM1640(大連寶生生物技術有限公司)。引物在北京生工生物工程有限公司設計及合成。MTT試劑盒(美國Invitrogen 公司)，All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國GeneCopoeia公司)。siAFAP-1L2及siNegative Control質粒由美國Addgene公司設計合成。

1.2 研究方法

1.2.1 實時定量PCR (qRT-PCR)法 依據RNA分離試劑盒及Trizol試劑說明書規定步驟進行細胞RNA提取并純化，按照逆轉錄及擴增試劑盒說明書步驟逆轉錄及擴增。取樣品的RNA給予純度和完整性測定，符合純度高、不存在蛋白質及DNA污染、總RNA抽取條件的完整細胞行PCR。各組細胞的cDNA為模板，設3個復孔，反應體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl，45×Syber Green 2 μl，Primer F 1 μl，Primer R 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 4 μl。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s；75 ℃ 30 s(共45個循環)，采用ΔΔCT法進行不同組別基因差異表達的比較。

1.2.2 siAFAP-1L2及siNegative Control轉染MiaPaCa-2細胞 試驗分組：轉染siAFAP-1L2的siAFAP-1L2組，轉染siNegative Control的siNegative control組。按照LipofectamineTM2000說明書步驟對對數期生長且24 h內融合達75%～95%的MisPaCa-2細胞進行轉染，轉染48 h后，應用Western blot、qRT-PCR法對AFAP-1L2蛋白、mRNA水平的轉染效率進行檢測，轉染效率約75%。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(Methyl-thiazolyl-tetrazolium，MTT) 取對數期生長MiaPaCa-2細胞制備單細胞懸液，依照MTT試劑盒說明，將細胞以1×104/孔密度接種于96孔的細胞培養板內，并設立3個復孔，常規細胞培養步驟進行培養，每孔內加5 mg/ml的MTT液 5 μl，在37 ℃條件下繼續溫育4 h，棄上清，每孔DMSO液150 μl，進行水平振蕩將結晶溶解，以酶聯免疫檢測法測定各孔的吸光度，重復3次試驗取平均值，繪制生長曲線。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將轉染后傳代的細胞轉移到EP管消化，按Annexin V/PI試劑盒操作說明進行凋亡檢測，取對數生長期的MiaPaCa-2細胞，以EDTA胰酶進行消化，采用 4 ℃預冷的PBS進行2次洗滌，離心條件為4 ℃下，300 r/min，重懸細胞，將濃度調整為1×106/ml。將100 μl細胞懸液加入流式管，添加Annexin V-FITC (5 μl)、PI (10 μl)，在避光、室溫條件下反應15 min，然后加入400 μl PBS，混勻后1 h內，樣品置于流式細胞儀進行檢測。記錄早期凋亡百分率，實驗重復3次。

2 結果

2.1 siAFAP-1L2轉染對胰腺癌細胞MiaPaCa-2增殖的影響 分別以不同濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)的siAFAP-1L2轉染胰腺癌細胞48 h后，與siNegative control組比較，12.5、25、50、100、200 nmol/L轉染siAFAP-1L2組細胞存活率較低，差異有統計學意義(P<0.05)；在培養24、48、72、96 h后，MiaPaCa-2細胞與siNegative control組比較，轉染siAFAP-1L2組細胞在48 h后存活率較低，差異有統計學意義(P<0.05)；siAFAP-1L2轉染后細胞存活率與siAFAP-1L2轉染濃度和時間具有相關性(r=-0.921，r=-0.907)。見圖1。下調AFAP-1L2表達降低胰腺癌細胞的存活率，并具有劑量、時間依賴性。

2.2 siAFAP-1L2轉染對胰腺癌細胞化療藥Gem敏感性的影響 將化療藥Gem 20 nmol/L加入分別以不同濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)siAFAP-1L2轉染的胰腺癌細胞，48 h后，與siNegative control組比較，25、50、100、200 nmol/L各轉染siAFAP-1L2組細胞存活率較低，差異有統計學意義(P<0.05)；將化療藥Gem 20 nmol/L加入siAFAP-1L2 100 nmol/L轉染的胰腺癌MiaPaCa-2細胞，培養24、48、72、96 h后，與siNegative control組比較，Gem對各濃度轉染siAFAP-1L2組細胞在72、96 h后存活率較低，差異有統計學意義(P<0.05)；siAFAP-1L2轉染后在Gem化療細胞存活率與siAFAP-1L2轉染濃度和時間具有相關性(r=-0.967，r=-0.984)。見圖2。下調siAFAP-1L2表達可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，并具有時間依賴性及劑量依賴性。

2.3 siAFAP-1L2轉染及化療藥Gem對MiaPaCa-2細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示，siAFAP-1L2+Gem組、siAFAP-1L2組的凋亡率分別為37.28%、11.65%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。siAFAP-1L2可以增強吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷作用。

3 討論

胰腺癌是惡性度最高的消化系統惡性腫瘤之一，其1年生存率低于25%，而5年生存率更是低于5%。確診時80%以上患者已經發生遠處轉移[7]。近年以手術為基礎的放療、化療等綜合治療手段沒有顯著提高胰腺癌的生存期及降低病死率[8]。作為細胞周期特異性抗代謝抗癌藥，吉西他濱作用于腫瘤細胞的S期，阻止細胞從G1期向S期進展，在胰腺癌化療中具有良好的療效，一定程度上提高了患者的生存期，但是化療的總體療效仍然非常有限[9]。化療附加靶向治療已經成為腫瘤治療的主要綜合治療方式[10]。本研究對AFAP-1L2表達進行下調，觀察其對胰腺癌細胞的作用及其對吉西他濱化療是否具有增效作用。

圖1 MTT檢測不同濃度梯度及培養不同時間MiaPaCa-2細胞存活率

圖2 MTT檢測Gem干預下不同濃度梯度及培養不同時間MiaPaCa-2細胞存活率

本研究顯示，siAFAP-1L2轉染后，胰腺癌細胞存活率與siAFAP-1L2轉染濃度和時間具有相關性，濃度越高或作用時間越長，胰腺癌細胞存活率越低。下調AFAP-1L2表達降低胰腺癌細胞的存活率，并具有劑量及時間依賴性。本課題組前期研究顯示，AFAP-1L2在胰腺導管腺癌組織中高表達，預示胰腺癌預后不良，是胰腺癌的預后獨立預測因素[5-6]。AFAP-1L2作用于下游PI3K/Akt信號通路，通過α-Akt磷酸化對PI3K/Akt通路活性進行調控，下調AFAP-1L2表達后阻斷了PI3K/Akt信號通路，從而降低了胰腺癌細胞的存活率。本研究進一步顯示，siAFAP-1L2轉染后，在Gem化療細胞存活率與siAFAP-1L2轉染濃度和時間存在相關性。下調siAFAP-1L2表達可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，并具有時間、劑量依賴性。siAFAP-1L2促進吉西他濱干預胰腺癌細胞的凋亡，增強吉西他濱對胰腺癌細胞的殺滅作用，下調AFAP-1L2表達可以使吉西他濱化療增效。前期對AFVAP-1L2作用機制的研究也顯示，AFAP-1L2下調減弱了MiaPaCa-2細胞增殖能力，停留在G1期細胞增多，在G2、S期比例減少，凋亡增加[5-6]。對AFAP-1L2表達進行干擾，可降低胰腺癌細胞的增殖能力，并使其停留在G1期細胞增多，凋亡率升高，PI3K/Akt信號通路受到抑制，磷酸化α-Akt減少，從而起到對胰腺癌細胞的殺滅作用。Shiozaki等[11]研究顯示，AFAP-1L2通過調控下游信號通路PI3K/Akt，促進α-Akt磷酸化，該通路對下游酪氨酸及色氨酸殘基進一步磷酸化，從而調控細胞周期、增殖及侵襲等行為。Zheng等[12]研究認為，抑制PI3K/Akt信號通路后，增殖及凋亡等胰腺癌細胞的活性減弱，同時增加腫瘤細胞對厄洛替尼化療敏感性。

綜上所述，下調AFAP-1L2表達可增強胰腺癌細胞吉西他濱化療敏感性，促進對胰腺癌細胞的殺傷作用，AFAP-1L2可作為胰腺癌治療靶向候選基因。